劉雪紅，崔素芹，劉南南，徐 桂

(1.濱州學院生命科學系，山東 濱州 256603； 2.濱州學院濱州市食品安全重點實驗室，山東 濱州 256603)

隨著對植物多倍體的產(chǎn)生途徑、特征及鑒定方法等方面的深入研究，誘導多倍體育種在育種領(lǐng)域逐漸顯示出日益廣闊的應用前景和發(fā)展空間。多倍體果樹一般具有生長健壯、枝粗、葉厚、果大、少籽或無籽、產(chǎn)量高、適應性強和抗逆性強等優(yōu)點，可用無性繁殖將這些優(yōu)點穩(wěn)定地遺傳給后代，而不出現(xiàn)分離。因此，多倍體育種倍受果樹育種研究者的青睞。

冬棗是我國棗品種中鮮食優(yōu)質(zhì)品種之一，果皮薄而脆，赭紅色，不裂果，果肉綠白色，細嫩，汁液多，甜味濃，品質(zhì)極上。研究結(jié)果表明，冬棗果肉內(nèi)除含有一般棗果中的營養(yǎng)物質(zhì)之外，還富含人體所需的19種氨基酸和維生素A、B、C、D等多種營養(yǎng)物質(zhì)，冬棗還含有鉀、鈉、鐵、銅等多種微量元素以及抗癌物質(zhì)環(huán)磷酸腺苷、環(huán)磷酸鳥苷等。

棗屬植物中存在大量的天然多倍體，如毛葉棗就存在四、六、八倍體類型，贊皇大棗是目前發(fā)現(xiàn)的唯一的天然三倍體品種。冬棗的敗育率較高，核內(nèi)均為單仁，優(yōu)良冬棗輕敗育品種的敗育率也達20%，因此冬棗多用嫁接技術(shù)進行繁殖。近年來，河北農(nóng)業(yè)大學棗研究中心用秋水仙素在田間和組織培養(yǎng)條件下誘導棗樹產(chǎn)生多倍體，已獲得冬棗、辣椒棗等品種的四倍體變異類型。筆者從誘導材料的選擇、誘導方法以及提高誘導效率的途徑等方面，對我國冬棗多倍體育種研究進行了簡要概述。

1 誘導材料的選擇

用于組織培養(yǎng)的外植體材料均可以用來誘導多倍體，其中秋水仙素對于正處于分裂期的細胞誘導成功率較高。因此，大多數(shù)學者都采用愈傷組織和叢生芽進行誘導。隨著誘導技術(shù)的逐漸成熟，也有用種子、離體組織成功誘導的報道。

1.1 種 子

用種子進行多倍體誘導以前多見于田間試驗，但由于溫度、光照條件的不確定性，對誘導結(jié)果有一定的影響。因此，現(xiàn)多用組織培養(yǎng)方法進行多倍體誘導。張蜀敏等用秋水仙素浸種法將未消毒的雪蓮種子分別浸泡在含有0.01%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%秋水仙素的二甲基亞砜（2%）中共處理6 h，然后將處理的種子消毒后，接種到MS基本培養(yǎng)基上。但是試驗結(jié)果并不理想，出現(xiàn)較多的嵌合體。

成熟胚的誘導效果不佳，學者們認為剛發(fā)育完整的幼胚可能效果會好些。在坐果40天左右，胚發(fā)育完整且成活率較高，將該時期的幼胚接種，離體條件下培養(yǎng)。幼胚接種后，主要有3種生活方式：一是形成愈傷組織，坐果后20～40天的幼胚接種后10天左右，子葉、胚軸均能出現(xiàn)愈傷組織，一些黃白色愈傷組織經(jīng)誘導可以形成小苗，但成苗率很低；二是子葉間出現(xiàn)增生物，坐果后30～55天的幼胚接種后，60%～70%的幼胚子葉間會出現(xiàn)小葉增生的現(xiàn)象，形成蓮座狀，80天左右胚軸伸長，形成一株正常苗；三是直接由胚萌發(fā)成苗。相對成熟的胚（坐果55天后）通常是直接萌發(fā)成苗，在幼胚長出愈傷組織或新生植株后，可用來做為誘導多倍體的材料。

1.2 愈傷組織

轉(zhuǎn)基因技術(shù)和多倍體誘導技術(shù)為棗的育種工作提供了新的平臺，通過愈傷組織途徑誘導多倍體可望實現(xiàn)加倍后的單細胞再分化成苗，從而可避免嵌合體的出現(xiàn)。而愈傷組織細胞分裂能力強，對秋水仙素較敏感，進行處理后比較容易出現(xiàn)多倍體。

1.2.1 冬棗花藥愈傷組織利用花藥或未傳粉子房培養(yǎng)誘導多倍體，再經(jīng)染色體加倍形成純合二倍體。這是利用現(xiàn)代生物技術(shù)進行植物品種選育的新方法。棗的花藥培養(yǎng)開始于20世紀90年代，最早僅在金絲小棗上有報道，但存在愈傷組織誘導率低的問題，而獲得優(yōu)良的愈傷組織是花藥培養(yǎng)成功的前提。王娜、劉孟軍等以我國最為著名的鮮食品種冬棗花藥為試材，探討了碳源種類、基本培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑對花藥愈傷組織誘導及增殖的影響，為棗的花藥培養(yǎng)及育種工作奠定了基礎(chǔ)。5～6月份選取直徑0.3～0.6 cm且花萼尚未張開的冬棗未成熟花蕾，置于4℃冰箱中預處理

1～3天后，用流水沖洗1～2 小時，轉(zhuǎn)入0.1% HgCl2溶液中處理8 分鐘，剝?nèi)』ㄋ幗臃N到各種處理培養(yǎng)基上。研究結(jié)果表明：在MS+麥芽糖20 g/L+TDZ 1.0 mg/L的培養(yǎng)基中，冬棗花藥愈傷組織誘導率最高，達86.8%，黃綠色松散狀的愈傷組織接種到含秋水仙素的培養(yǎng)基可誘導形成多倍體。

1.2.2 葉片愈傷組織寧強等人在組織培養(yǎng)條件下，以冬棗組培苗的葉片為材料，使用TDZ和NAA結(jié)合，誘導出生長良好的愈傷組織，為冬棗葉片再生體系的建立，以及進一步的冬棗轉(zhuǎn)基因和多倍體育種奠定了基礎(chǔ)。

1.3 叢生芽

王娜、劉孟軍等以冬棗和酸棗的組培苗叢芽為材料，研究了秋水仙素誘導染色體倍性變異的最佳濃度與時間組合、多倍體的特征及純化技術(shù)。結(jié)果表明，最佳組合為50 mg/L秋水仙素處理40天，誘導冬棗和酸棗染色體加倍的頻率分別達到了36.37%和26.67%。嵌合體經(jīng)3～4次繼代分離得到純化，并對純化后的變異植株進行了增殖和生根，變異株根尖染色體加倍（2n=4X=48），葉片增厚，柵欄組織、海綿組織明顯發(fā)達，充分表明獲得的變異株為同源四倍體。蔣洪恩等在田間人工誘導獲得了冬棗、辣椒棗的四倍體和八倍體材料，但未完全純化。

1.4 莖 段

組織培養(yǎng)的莖段比較嫩，易于誘導形成多倍體。王娜、劉孟軍等以二倍體冬棗和酸棗的組培苗莖段為料材，以秋水仙素為誘變劑，在組織培養(yǎng)條件下首次獲得了冬棗和酸棗的純合四倍體植株，結(jié)果顯示用0.9%秋水仙素溶液浸泡2天，誘導效果較好。

2 誘導多倍體的方法

2.1 物理誘導方法

1890～1901年，俄國學者格拉希莫夫用人工方法獲得多倍體后，許多科學工作者都開展了人工誘導多倍體方法的研究。多倍體的物理誘導方法有溫度激變、機械創(chuàng)傷、離心力、紫外線、X射線和滲透壓改變等，這些方法的普遍缺陷就是誘導率低。后來由于化學誘導劑的發(fā)現(xiàn)，完全取代了物理誘導手段，這些方法也已不再使用。

2.2 化學藥劑誘導

可誘導多倍體的化學藥劑有很多，如秋水仙素、吲哚乙酸、苯及其衍生物、有機砷制劑、磺胺劑及其它植物堿、麻醉劑和生長素等，約有數(shù)百種。但使用最多、效果最好的是秋水仙素。利用秋水仙素阻礙紡錘絲的形成，使中期染色體數(shù)目加倍。用秋水仙素處理分裂旺盛的植物組織就可以獲得理想的多倍體。萌發(fā)的種子和生長點是最好的誘導材料。常用的方法有以下幾種：一是浸漬法，將幼苗、新梢、插條、接穗和種子等實驗材料直接浸泡在秋水仙素溶液中，溶液濃度一般為0.05%～1%，為避免蒸發(fā)應加蓋并在黑暗條件下處理，發(fā)芽的種子一般處理數(shù)小時至3天，插條、接穗、幼苗一般處理幾天；二是涂抹法，把秋水仙素按一定濃度配成乳劑或混于羊毛脂膏內(nèi)，涂抹在幼苗或枝條的頂端及花芽上；三是液滴法，常用秋水仙素的濃度為0.1%～1.0%，用脫脂棉包裹幼芽或花芽，每天滴一至數(shù)次，反復處理幾日，使溶液透過表皮滲入組織內(nèi)而起作用，寧強、劉孟軍等用液滴法處理人為條件下在冬棗枝條上形成的愈傷組織，當秋水仙素的濃度為0.05%，處理18小時其誘變效率最高；四是注射法，用注射器將秋水仙素藥液注入植株的芽或生長點，溶液濃度一般為0.4%左右；五是藥劑培養(yǎng)基法，在材料的離體培養(yǎng)基中加入一定濃度的秋水仙素溶液，將外植體共培養(yǎng)一段時間后轉(zhuǎn)到不含有秋水仙素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

秋水仙素的處理濃度和時間因處理對象的不同而異，一般在0.01%～1.0%以內(nèi)都是有效的，在對某一植物作初次誘導試驗時，一般采用低濃度長期處理的方法。

蔣洪恩、劉孟軍以二倍體冬棗、梨棗和辣椒棗的新生棗頭為試材，經(jīng)秋水仙素溶液誘變處理，首次獲得了梨棗、冬棗和辣椒棗的八倍體材料，結(jié)果表明誘導不同品種的多倍體其最佳處理時間和濃度組合不同。梨棗的最佳處理組合為0.15%的秋水仙素處理18 小時，誘變率為50%；辣椒棗的最佳處理組合為0.1%的秋水仙素處理30 小時，誘變率為43.3%；冬棗的最佳處理組合為0.15%的秋水仙素處理18 小時，誘變率也為43.3%。

寧強、劉孟軍等以二倍體冬棗和梨棗的愈傷組織為材料，用秋水仙素對愈傷組織進行誘變，首次獲得了四倍體植株，結(jié)果表明，不同品種、不同秋水仙素濃度和處理時間對愈傷組織的誘變效果不同。對梨棗而言，0.05%的秋水仙素濃度處理24小時效果最好，愈傷組織變異率達到13.3%；而對冬棗來說，0.05%的秋水仙素濃度處理8 小時效果最好，愈傷組織變異率達到6.7%。

2.3 利用組織培養(yǎng)技術(shù)誘導多倍體

利用組織培養(yǎng)誘導多倍體的方法是最近十幾年科研工作者采用較多的方法，該方法誘導率高，并可以克服同源多倍體育性低的缺陷，有較大的發(fā)展?jié)摿?。組織培養(yǎng)中使細胞染色體加倍的因素很多。據(jù)報道，不同培養(yǎng)基的物理狀態(tài)對二倍體和多倍體的選擇壓力不同。培養(yǎng)基中加入適當濃度2,4-D及其它激素也可增加培養(yǎng)物上多倍體細胞的含量。但實際應用中最多的仍是秋水仙素?？蓪⑶锼伤丶尤肱囵B(yǎng)基中進行誘導培養(yǎng)，也可先用秋水仙素溶液浸泡愈傷組織，再直接接種到培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。

不同材料、不同處理方法對組培苗的誘變效果不同，其中叢芽的混培率最高。嚴仁玲等在組織培養(yǎng)條件下成功地將二倍體金絲小棗誘導出了四倍體植株。王娜、劉孟軍等用冬棗和酸棗的二倍體組培苗為材料，以秋水仙素為誘變劑在組織培養(yǎng)條件下首次獲得了酸棗和冬棗的純合四倍體植株。酸棗和冬棗叢芽的最佳處理時間和濃度組合均為含50 mg/L秋水仙素的MS培養(yǎng)基混培4天，誘變頻率分別為36.67%和26.67%。酸棗莖段最低處理時間和濃度組合為0.4%的秋水仙素溶液浸泡處理4天，誘變頻率為23.33%；冬棗莖段最佳處理時間和濃度組合為0.4%秋水仙素浸泡處理2天，誘變頻率為16.67%。相比之下，混培法更適合于叢芽誘變，浸泡法更適合于莖段誘變。酸棗的誘變頻率明顯高于冬棗。

不同材料、不同處理時間對愈傷組織的誘變效果不同。寧強等以冬棗和辣椒棗葉片為試材，在離體條件下誘導愈傷組織的形成，并利用秋水仙素對愈傷組織進行浸泡法和根培法處理。對于冬棗而言，浸泡葉片愈傷組織，秋水仙素溶液濃度0.01%處理4天，變異率最高為13.3%；混培法中，對葉片進行10天的預培養(yǎng)，秋水仙素濃度0.004%處理15天的變異率最高達6.7%。

3 提高組培苗誘變效率的途徑

王娜、劉孟軍等以冬棗組培苗叢芽和莖段為材料，以秋水仙素為誘變劑，研究了預培養(yǎng)、暗培養(yǎng)、二甲基亞砜和活性炭對誘導多倍體均有一定的影響作用。實驗表明：對組培苗莖段進行4天預培養(yǎng)時，冬棗變異率最高，可達10%；對組培苗叢芽進行15天暗培養(yǎng)的處理，致死率最低、變異率最高，冬棗變異率為26.67%。

二甲基亞砜是一種誘變輔助劑，能夠幫助處理材料吸收秋水仙素，但當二甲基亞砜的濃度偏高時會使材料致死率升高。活性炭可通過降低處理材料的褐化來提高誘變效率。因此，離體條件下提高誘變率的關(guān)鍵因素之一是抓住細胞旺盛分裂的時機進行誘變，使盡可能多的細胞加倍，以減少嵌合體出現(xiàn)的幾率，或縮短嵌合體分離的過程。另一關(guān)鍵因素是降低處理材料的死亡率，使加倍的細胞盡可能多的存活下來。

4 冬棗多倍體育種現(xiàn)狀

4.1 冬棗多倍體育種中存在的問題

冬棗棗胚敗育率高，一般不是直接采用種子作為誘導材料，而是在組織培養(yǎng)條件下，選取莖組培苗莖尖、莖段、叢生芽為試材，通過誘導愈傷組織或直接進行多倍體誘導。如以愈傷組織作為誘導材料，則愈傷組織分化率低，不易長成幼苗。而且在多倍體誘導過程中發(fā)生加倍效應的往往是部分細胞，嵌合體的產(chǎn)生是難以避免的，能否對嵌合體進行及時有效地分離成為獲得同源多倍體的關(guān)鍵因素。

4.2 多倍體中嵌合體與純合體的比較

在誘導植物多倍體時，嵌合體是一種較為常見的現(xiàn)象。在嵌合體細胞的競爭過程中，細胞倍性的發(fā)展方向具有不確定性，若二倍體在嵌合體中占優(yōu)勢，多倍體就會在競爭中逐漸消失而使材料恢復為二倍體；相反若四倍體細胞占優(yōu)勢，則材料可以形成穩(wěn)定的四倍體。目前解決嵌合體最好的方法是選擇單細胞或單細胞起源的誘導材料，如葉片外植體愈傷組織，原生質(zhì)體等。

4.3 田間誘導與離體誘導

4.3.1 從誘導方法上來看田間誘變常采用秋水仙素涂抹法，使誘變劑直接與生長點接觸促使其發(fā)生變異，該方法直接作用于生長點，易產(chǎn)生變異；但也加重了對生長點的傷害，不適合于像冬棗這些對秋水仙素忍耐力較弱的材料。材料離體誘導一般有兩種方法：秋水仙素溶液浸泡法及秋水仙素培養(yǎng)基混培法。混培法是比較適合于離體材料誘變的一種低濃度長時間的處理方法，且混培法比田間誘導簡單得多，不需要逐株進行處理，只需將秋水仙素加入到培養(yǎng)基中，同時可處理大量材料，節(jié)省了人力物力。

4.3.2 從嵌合體分離來看蔣洪恩認為，田間條件下可采用修剪法對嵌合體進行純化，但這種方法操作繁瑣，而且并不能得到純合體植株。而在離體條件下，嵌合體的分離可及時進行，且操作簡單便捷。

4.3.3 從對變異株的鑒定來看 無論是田間誘變還是離體誘變，都可以通過形態(tài)觀察來對誘變材料進行初期鑒定。離體條件下，還可在不影響組培苗正常生長的情況下，通過檢測根尖或葉片的染色體倍性來確定材料的變異情況。

因此，利用組織培養(yǎng)可以同時誘導大量材料，而且培養(yǎng)條件容易控制，重復性好，易于進行嵌合體的分離及多倍體的鑒定，得到的四倍體植株當年就可大量擴增。這預示著利用組織培養(yǎng)離體誘導多倍體，有可能廣泛適用于其它建立高效組織培養(yǎng)再生體系的各種作物，從而在染色體工程中具有廣闊的應用前景。

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