肖 鋼，鄔賢夢，張振乾，宋志榮，康國章，官春云*

(1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所，長沙 410128；2 湖南省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，長沙 410005；3 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家小麥工程技術(shù)研究中心，鄭州 450002)

甘藍(lán)型油菜(Brassica napusL)是中國廣泛栽培的一種重要油料作物。 油菜籽中硫苷含量是衡量其品質(zhì)性狀的重要指標(biāo)。籽粒餅粕中的硫苷在芥子酶的作用下，會(huì)分裂產(chǎn)生異硫氰酸脂、惡唑烷硫酮及腈等有毒物質(zhì)，限制了油菜餅粕資源的利用[1,2]。油菜植株內(nèi)的硫苷及其水解產(chǎn)物對增強(qiáng)油菜抗性具有十分重要的作用[3,4]，特別是在防御昆蟲侵犯和食植昆蟲的寄主定位，以及抵御細(xì)菌和真菌等方面發(fā)揮了重要的作用[5～7]。簡單序列重復(fù)(Simple Sequence Repeat，SSR)是由1～6 bp形成的重復(fù)單元組成[8]。SSR標(biāo)記一般表現(xiàn)為共顯性遺傳，廣泛分布于基因組的編碼區(qū)與非編碼區(qū)，由于其檢測方法簡單快捷，重復(fù)性好，因而被廣泛應(yīng)用于遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、基因定位、遺傳多樣性分析和標(biāo)記輔助選擇育種等。波蘭、加拿大、法國等國家的植物育種和遺傳工作者在20世紀(jì)70年代相繼開展了硫苷性狀的遺傳研究[9]。目前，國內(nèi)外采用分子標(biāo)記技術(shù)對油菜硫苷性狀進(jìn)行研究的報(bào)道較少。本研究以硫苷含量差異較大而其它農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀相近的967H、967L油菜品系為試驗(yàn)材料，對親本、F1、F2植株進(jìn)行SSR標(biāo)記分析，尋找與硫苷含量性狀連鎖的SSR標(biāo)記，分析其對硫苷含量的貢獻(xiàn)率，旨在為低硫苷性狀基因的進(jìn)一步定位、克隆以及合理利用硫苷性狀提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試油菜品系為967H、967L，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所提供。967H、967L是從品種湘農(nóng)油571中分離出的高硫苷和低硫苷品系，并經(jīng)過連續(xù)6代自交后得到，除硫苷性狀差異較大外，其它主要農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀相似，性狀穩(wěn)定，親緣關(guān)系相近。967H硫苷含量為107.48 μmol/g，967L硫苷含量為34.40 μmol/g。58對SSR引物序列來源于網(wǎng)址http://www.ukcrop.net；15對SSR引物采用EMBL基因數(shù)據(jù)庫中的Primer5軟件設(shè)計(jì)；另外20對引物選自Tonguc[10]的研究報(bào)告，上述引物均由北京博奧生物有限公司和上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 群體構(gòu)建

田間試驗(yàn)在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜試驗(yàn)基地進(jìn)行。2005年9月27日播種，行距40 cm，株距18 cm；2006年3～4月進(jìn)行正反雜交，5月獲得F1代種子，9月28日種植正反交F1代各100株，選擇親本、F1代植株各10株進(jìn)行花期套袋自交；2007年5月獲得F2代種子，9月分別種植親本、F1代材料各4行，F(xiàn)2代20行，每行10株。繼續(xù)對親本進(jìn)行雜交，對F1、F2進(jìn)行套袋自交；2008年5月獲得親本、F1、F2、F3等世代種子。

1.2.2 油菜基因組DNA的提取及基因池的構(gòu)建

F2群體在營養(yǎng)生長階段，每個(gè)單株取嫩葉提取基因組DNA。用于分離群體分組分析的基因池參照Michelmore的BSA方法構(gòu)建[11]，等量取20個(gè)高硫苷親本單株DNA混合建立高硫苷池，等量取20個(gè)低硫苷親本單株DNA混合建立低硫苷池。

1.2.3 SSR標(biāo)記分析

PCR 體系為 10 μL，其中10×Buffer 1.0 μL，20 mmol/L Mg2+0.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.3 μL，10 μmol/L SSR 引物各 0.5 μL，5 U/μLTaq酶 0.1 μL，模板 DNA 1 μL (50 ng)，ddH2O 6.1 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，47℃退火30 s，72℃ 延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸2 min，4 ℃下保存。擴(kuò)增在 TGadient 96 PCR擴(kuò)增儀(德國Biometra) 上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳和銀染參照Tixier等[12]的方法。PCR產(chǎn)物用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳緩沖液為0.5×TBE，70 W恒功率電泳1.5 h后銀染檢測，記錄帶型。

用93對SSR引物篩選兩個(gè)親本967 H、967 L以及高硫苷池和低硫苷池間的多態(tài)性標(biāo)記。對高硫苷池和低硫苷池間產(chǎn)生的穩(wěn)定多態(tài)性的標(biāo)記，用F2群體驗(yàn)證其與油菜硫苷性狀基因的連鎖關(guān)系。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)SSR標(biāo)記的分析結(jié)果，將各單株系和親本相應(yīng)位點(diǎn)的帶型進(jìn)行比較，與親本967H相同帶型的標(biāo)記記為A，與親本967L相同帶型的標(biāo)記記為B，雙親的雜合帶型記為H。用DPS統(tǒng)計(jì)軟件對F2群體的帶型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 硫甙含量的測定

硫甙含量的測定采用劉恒烈等[13]的內(nèi)源酶法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物的篩選

利用93對SSR引物，對高硫苷親本967H和低硫苷親本967L進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測。部分引物擴(kuò)增出的帶較弱。有18對引物不能擴(kuò)增出任何帶型，占引物總數(shù)的14.40%。有 8對引物能夠在高硫苷親本和低硫苷親本之間擴(kuò)增出穩(wěn)定清晰的差異帶，占引物總數(shù)的6.40%。

用8對能夠在雙親間擴(kuò)增出差異帶的SSR引物對高、低硫苷基因池進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，篩選出1對在2池間穩(wěn)定表現(xiàn)多態(tài)性的SSR引物CB10364(圖1)。

圖1 引物CB10364在高、低硫苷基因池間的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig. 1 PCR analysis of SSR primer CB10364 in high and low glucosinolate DNA bulks

2.2 SSR標(biāo)記的 F2群體檢測及硫苷性狀連鎖關(guān)系分析

用SSR引物CB10364對F2群體的180個(gè)單株進(jìn)行擴(kuò)增(圖2)，F(xiàn)2群體PCR擴(kuò)增結(jié)果共有3種帶型，即高硫苷親本帶型、低硫苷親本帶型和雜合帶型。統(tǒng)計(jì)各帶型的植株數(shù)，分析硫苷含量，并進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表明：具有A帶型的F2植株的種子平均硫苷含量(96.28 μmol/g)極顯著高于H帶型(78.27 μmol/g)，具有H帶型的F2植株的種子平均硫苷含量極顯著高于B帶型(64.36 μmol/g)。

圖2 引物CB10364在雙親、F1及部分F2群體中SSR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR analysis of SSR primer CB10364 in parents, F1 and F2 group

對 CB10364標(biāo)記的連鎖相關(guān)性和對低硫苷性狀的貢獻(xiàn)率進(jìn)行分析(表1)，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記CB10364與低硫苷性狀的連鎖相關(guān)性達(dá)極顯著水平(F=46.32，p＜0.001)，單標(biāo)記檢測到的 QTL對該群體硫苷含量的貢獻(xiàn)率為34.36%。

表1 SSR標(biāo)記CB10364在F3代中的硫苷含量方差分析Table 1 Variance analysis of SSR marker CB10364 associated with glucosinolate content traits in F3 population of 967H and 967L

3 結(jié)論與討論

本研究從 F2分離群體中選取數(shù)量相等的高硫苷單株和低硫苷單株，產(chǎn)生兩個(gè)混合DNA樣品池，在高硫苷基因池、低硫苷基因池中找到了 1個(gè)差異明顯的SSR引物CB10364。該引物標(biāo)記穩(wěn)定、重復(fù)性好，為共顯性。通過對F2群體進(jìn)行篩選驗(yàn)證，該引物產(chǎn)生的標(biāo)記CB10364與硫苷含量性狀相連鎖，對油菜低硫苷性狀的貢獻(xiàn)率為34.36%。

菜籽中硫苷的降解產(chǎn)物對動(dòng)物有害，極大地限制了油菜籽蛋白的利用。油菜中硫苷性狀是受多基因控制的數(shù)量性狀，有研究表明[14]至少受3～6對基因控制，遺傳比較復(fù)雜。并且栽培技術(shù)和環(huán)境因素等對植株籽粒硫苷含量有較大影響，據(jù)國外研究[15]報(bào)道，施肥等栽培措施也可以使硫苷含量相差8 μmol/g以上，因此，采用傳統(tǒng)的方法研究油菜硫苷含量的遺傳十分困難。而采用分子標(biāo)記對控制硫苷合成的基因進(jìn)行定位對研究硫苷的遺傳帶來極大便利。

[1]Opalka M，Dusza L，Koziorowski M，et al．Effect of long-term feeding with graded levels of low glucosinolate rapeseed meal on endocrine status of gilts and their piglets[J]．Livestock Production Science，2001，69(3)：233?243．

[2]劉 念，蒙大慶，湯天澤，等．油菜硫代葡萄糖苷檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J]．湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50(7)：1301?1304．

[3]Bhardwaj HL，Hamama AA．Acumulation of glucosinolate，oil，and erucic acid in developingBrassicaseeds[J]．Industrial Crops and Products，2003，17(1)：47?51．

[4]Agerbirk N，Orgaard M，Nielsen JK．Glucosinolates，flea beetl resistance and leaf pubescence as taxonomic characters in the genus Barbarea (Brassicaceae) [J].Phytochemistry，2003，63(1)：69?80．

[5]Kliebenstein D，Pedersen D，Barker B，et al．Chemical defenses of crucifers：elicitation and metabolism of phytoalexins and indole-3-acetonitrile in brown mustard and turnip[J]．Phytochemistry，2002，59：611?625．

[6]Wittstock U，Agerbirk N，Stauber EJ，et al．Successful herbivore attack due to metabolic diversion of a plant chemical defense [J]．Proc Natl Acad Sci，2004，101(14)：4859?4864．

[7]Buskov S，Serra B，Rosa E，et al．Effects of intact glucosinolates and products produced from glucosinolates in myrosnase-catalyzed hydrolysis on the potato cyst nematode (Globodera rostochiensisev．Woll) [J]．J Agric Food Chem，2002，50(4)：690?695．

[8]Akkaya MS，Bhagwat AA，Cregan PB．Length polymorphhisms of simple sequence repeat DNA in soybean [J].Genetics，1992，132(4)：1131?1139．

[9]牟同敏，劉后利．甘藍(lán)型油菜種子中硫代葡萄糖苷總量的遺傳分析[J]．作物學(xué)報(bào)，1990，16(2)：97?105．

[10]Tonguc M，Griffiths PD．Genetic relationships ofBrassicavegetables determined using database derived simple sequence repeats [J]．Euphytica，2004，137(2)：193?201．

[11]Michelmore RW，Kesseli RV，Kesseli RV．Identification of markers linked to disease resistance genes by bulked segregant analysis：a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating population[J]．Proc Nati Acad Sci USA，1991，88(21)：9828?9832．

[12]Tixier MH，Sourdille P，Roder M．Detection of wheat microsatellites using a nonradioactive silver nitrate staining method [J]．J Genet Breed，1997，51(2)：175?177．

[13]劉恒烈，戰(zhàn)廣琴．油菜籽中硫苷總量測定方法—內(nèi)源酶法[J]．中國油料，1994，16(4)：46?49．

[14]王 維．我國油菜品種的改良研究歷史[J]．青海農(nóng)技推廣，2006，9(1)：11?12．

[15]Zhao FJ，Evans EJ，Bilsborrow PE，et al．Sulphur uptake and distribution in double and single low varieties of oilseed rape (Brassica napusL) [J]．Plant and Soil，1993，150(1)：69?76．