譚文波 王振富

湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 恩施 445000

馬鞭草 (Verbena officinalis L.)為馬鞭草科馬鞭草屬植物馬鞭草的全草，具有清熱解毒、通經(jīng)散瘀、利尿消腫、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的軸突生長(zhǎng)等功效［1］。常用于治療咽喉腫痛，跌打損傷等癥”。湖北恩施馬鞭草資源極為豐富，在民間已有廣泛的應(yīng)用，有很好的藥用開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值［2］。馬鞭草苷具有多種藥理活性，尤其是在神經(jīng)保護(hù)方面，其作用機(jī)制更是多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多途徑，因此對(duì)老年癡呆、帕金森氏病等神經(jīng)退行性病變的防治具有很好的作用［3］。目前有關(guān)馬鞭草防治老年癡呆作用的研究尚無(wú)完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)道。為此，我們觀察本地區(qū)馬鞭草水煎液對(duì)AD模型小鼠的保護(hù)作用，旨在為進(jìn)一步研制開(kāi)發(fā)該藥提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 2月齡KM種小鼠40只，體重20.0±2.1g，雌雄各半，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 藥物與試劑 馬鞭草水煎液：取購(gòu)于恩施藥材公司的馬鞭草，用水煎煮3次，過(guò)濾后，濃縮成lg/ml的溶液，即得 (水煎液由本院自制)。維生素E(盛澤化工)，D-半乳糖 (上海恒信化學(xué)試劑有限公司)，小鼠總β淀粉樣蛋白 (Aβ)Elisa試劑盒 (上海博耀生物科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及器械 GL-20GII型高速低溫離心機(jī)，避暗實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)，Multikan MK3酶標(biāo)儀，電子分析天平，內(nèi)切式組織勻漿機(jī)，低溫冰箱。

2 方法

2.1 分組及給藥 40只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、馬鞭草組和陽(yáng)性組，每組10只，雌雄各半。除對(duì)照組外，其他各組均每天頸背部皮下注射5%D-半乳糖生理鹽水溶液0.025ml/g，對(duì)照組每天頸背部皮下注射等量的生理鹽水，連續(xù)注射42d。造模同時(shí)開(kāi)始灌胃給藥，馬鞭草組按20g/kg體重給藥，陽(yáng)性組給予維生素E 50mg/kg灌胃，對(duì)照組與模型組每天灌服等量生理鹽水，連續(xù)用藥42d。

2.2 避暗實(shí)驗(yàn) 于43d將小鼠背著洞口放人明室，記錄首次放入5min內(nèi)小鼠進(jìn)入暗室被電擊次數(shù) (錯(cuò)誤次數(shù))，作為學(xué)習(xí)獲得成績(jī);24h后再次測(cè)驗(yàn)，記錄潛伏期 (即將小鼠放人明室開(kāi)始計(jì)時(shí)，到鼠體1/3進(jìn)入暗室觸電的時(shí)間)和5min內(nèi)小鼠進(jìn)入暗室被電擊次數(shù) (錯(cuò)誤次數(shù))，作為記憶保持成績(jī)。

2.3 Aβ含量測(cè)定 行為學(xué)測(cè)試后，摘取小鼠眼球取血約1ml，血液離心取血清置于4℃冰箱儲(chǔ)存待測(cè)。取血后，迅速斷頭取腦，放入冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱(chēng)重，放入玻璃勻漿器中，加入冷的生理鹽 (生理鹽水的體積總量是腦組織重量的9倍)，用內(nèi)切式組織勻漿器進(jìn)行勻漿 (勻漿時(shí)間10秒/次，間隙30秒，連續(xù)5～6次，在冰水中進(jìn)行)。將制備好的10%勻漿用低溫離心機(jī)3000r/min左右離心10～15分鐘，取適量離心好的勻漿上清液備用。Aβ含量測(cè)定按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有結(jié)果用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 馬鞭草水煎液對(duì)AD模型小鼠避暗實(shí)驗(yàn)的影響見(jiàn)表1。從表1可見(jiàn)，與對(duì)照組小鼠比，AD模型組小鼠的首次避暗錯(cuò)誤次數(shù)和24h后避暗錯(cuò)誤次數(shù)明顯增多，24h避暗潛伏期明顯縮短 (P＜0.01)，表明AD模型組小鼠出現(xiàn)了學(xué)習(xí)記憶障礙;與模型組小鼠比，馬鞭草組及陽(yáng)性組小鼠，首次避暗錯(cuò)誤次數(shù)和24h后避暗錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少，24h避暗潛伏期明顯延長(zhǎng) (P＜0.01)，說(shuō)明馬鞭草改善其學(xué)習(xí)及記憶能力，具有明顯促智作用。

表1 避暗實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

3.2 馬鞭草水煎液對(duì)AD模型小鼠Aβ含量的影響見(jiàn)表2。

表2 Aβ含量測(cè)定結(jié)果

從表2可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，AD模型組小鼠的總β淀粉樣蛋白在血清和腦組織的含量都顯著增加 (P＜0.01)，表明D-半乳糖可增加小鼠β淀粉樣蛋白的表達(dá);與模型組小鼠比較，馬鞭草組及陽(yáng)性組小鼠血清和腦組織內(nèi)β淀粉樣蛋白的含量顯著降低 (P0.01)，表明馬鞭草抑制了AD模型小鼠β淀粉樣蛋白的表達(dá)。

4 討論

老年癡呆癥又稱(chēng)阿爾茨海默病，是發(fā)生在老年期及老年前期的一種原發(fā)性退行性腦病。臨床表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能不斷惡化。其特征性病理變化為大腦皮層萎縮，并伴有β淀粉樣蛋白沉積，神經(jīng)原纖維纏結(jié)，大量記憶性神經(jīng)元數(shù)目減少，以及老年斑的形成。

本實(shí)驗(yàn)以5%D-半乳糖生理鹽水溶液按0.025ml/g頸背部皮下注來(lái)制備AD小鼠模型。通過(guò)避暗行為學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組小鼠比較，較AD模型組小鼠首次避暗錯(cuò)誤次數(shù)和24h后避暗錯(cuò)誤次數(shù)明顯增多，避暗潛伏期明顯縮短 (P＜0.01)，表明AD模型小鼠出現(xiàn)了明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙，說(shuō)明老年癡呆小鼠模型的制備是成功的。但與模型組小鼠比較，馬鞭草水煎液治療組及維生素E治療組小鼠，首次避暗錯(cuò)誤次數(shù)和24h后避暗錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少，避暗潛伏期明顯延長(zhǎng) (P＜0.01)，說(shuō)明馬鞭草水煎液改善了其定向?qū)W習(xí)及記憶能力，對(duì)老年癡呆小鼠具有明顯的治療作用。

Aβ的神經(jīng)毒性學(xué)說(shuō)是目前公認(rèn)的老年癡呆癥發(fā)生的最主要原因。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為，沉積在神經(jīng)元周?chē)腁β通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡造成AD神經(jīng)元丟失;Aβ分子的β片層結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)Aβ聚集成不溶性纖維，不易被蛋白酶降解，進(jìn)一步形成極難溶的沉淀，由此生成老年斑;淀粉樣斑塊部位氧化應(yīng)激升高而造成老化損傷［4，5］。這種經(jīng)毒性損傷會(huì)促使老年癡呆癥出現(xiàn)特征性病理變化。形成這種變化的直接原因是β淀粉樣蛋白的過(guò)度表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組小鼠的β淀粉樣蛋白在血清和腦組織的含量都顯著增加(P＜0.01)，與模型組小鼠比較，馬鞭草組及陽(yáng)性組小鼠血清和腦組織內(nèi)β淀粉樣蛋白的含量顯著降低 (P＜0.01)，說(shuō)明D-半乳糖通過(guò)增加小鼠β淀粉樣蛋白的表達(dá)，造成神經(jīng)毒性損傷，使其衰老癡呆;而馬鞭草水煎液可抑制AD模型小鼠β淀粉樣蛋白的表達(dá)，從而有效地避免了神經(jīng)毒性損傷，使AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力得到明顯的改善。證明馬鞭草水煎液能提高AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，β淀粉樣蛋白表達(dá)水平降低可能是其作用機(jī)制之一。

［1］謝宗萬(wàn).全國(guó)中草藥匯編 (上冊(cè))［M］.第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：352-353.

［2］楊付明.湖北恩施地區(qū)治療疑難雜癥用藥概要［J］.中國(guó)民族民間醫(yī)藥雜志，2003，03：154-155.

［3］陳興麗，孟巖，張?zhí)m桐.馬鞭草化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展［J］.河北醫(yī)藥，2010，32(l5)：2089-2091.

［4］Soledad Miranda.The role of oxidative in the toxicity induced by amyloid β -peptide in Alzheimer’disease［J］.Progress in Neurobiology，2O0O，62(8)：633-648.

［5］ Christian Behi.Alzheimer’s disease and oxidative stress：implications for novel therapeutic approaches［J］.Porg Neurobiol，1999，57：301-323.