王燈亮， 康德智， 張元隆， 林章雅， 林元相， 余良宏

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)主要是顱內動脈瘤破裂出血引起，并出現(xiàn)不同程度的腦血管痙攣(cerebral vasospasm CVS)，是引起高致殘率、致死率的主要原因之一。雖然對SAH后血管痙攣的機制研究較多，有學者報道稱多因子機制參與了腦血管痙攣的發(fā)生［1］，但目前其具體發(fā)生機制仍不十分清楚。

NO是一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)的催化產(chǎn)物，作為一種氣體，NO不容易直接測量，因此，常通過對NOS的研究來間接反應NO生物學作用。根據(jù)組織來源可將NOS分為內皮型(eNOS)、神經(jīng)元型(nNOS)和誘導型(iNOS)。近來有研究顯示eNOS功能紊亂可能參與腦血管痙攣的發(fā)展［2］。

本實驗通過兔枕大池二次注血法建立SAH后CVS的模型，運用Western blotting觀察在SAH后不同時間點eNOS表達的變化，旨在探討eNOS與SAH后腦血管痙攣的關系，從而進一步有助于臨床上的診斷和治療。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 研究對象為72只新西蘭大白兔由上海生旺實驗動物養(yǎng)殖有限公司提供許可證號 SCXK(滬)2007-0007，雌雄不限，體重為2.0～2.8kg，自由進食，晝夜節(jié)律喂養(yǎng)。主要實驗試劑為eNOS多克隆抗體(武漢伊艾博科技有限公司提供)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組 成年新西蘭大白兔72只，隨機分成以下兩組:(1)對照組(12只)，枕大池注入生理鹽水;(2)SAH組(60只)，按時間隨機分為術后 1d、3d、5d、7d、10d 5 個亞組，每組 12 只，經(jīng)手術于枕大池注入兔自體耳中央動脈血。

1.2.2 兔SAH模型的制作 采用枕大池二次注血方法建立穩(wěn)定的蛛網(wǎng)膜下腔出血模型。以鹽酸氯氨酮30mg/kg和氯丙嗪7.5mg/kg肌肉注射進行麻醉。枕部剃毛，俯臥位固定，消毒后于枕部中線作一直切口，長2.5cm，鈍性分離直達寰枕筋膜，2ml注射器針頭經(jīng)皮穿刺枕大池，此時可見清亮腦脊液流出，按照0.4ml/kg放出腦脊液后，立即從兔耳中央動脈抽取等量非抗凝動脈血緩慢注入枕大池中。首次注血0.4ml/kg，48h后重復上述操作，注入動脈血0.2ml/kg。二次注血24h后為SAH后第1天，依次類推。對照組在放完腦脊液后注入等量生理鹽水，余操作同實驗組。

1.2.3 活體灌注 予鹽酸氯氨酮30mg/kg和氯丙嗪7.5mg/kg肌肉注射對兔進行麻醉。打開胸腔，剝開心包膜，將下腔靜脈和腹主動脈用動脈夾夾閉，剪開右心耳放出血液，再剪開左心室將灌注頭插入主動脈然后用動脈夾固定。行HE染色檢查的兔子先輸入500ml生理鹽水將血管內的血沖洗凈，再注入500ml的多聚甲醛固定液固定。行石蠟包埋后備做檢查。行 Western blotting檢測的兔子灌入500ml 4℃預冷生理鹽水，灌注后取出腦組織和基底動脈，之后將基底動脈分離出來，置于凍存管中，放入液氮灌中速凍后轉入－80℃長期保存。

1.2.4 標本制作及組織學評價 經(jīng)甲醛固定的腦及血管組織石蠟包埋，在每個基底動脈的近、中、遠段的中點取材，每點連續(xù)取1個切片，層厚4μm，切片經(jīng)蘇木素-伊紅染色后，采用 Leica DM2500顯微鏡以及Image-Pro Plus(Version 5.1)圖像分析軟件測定每個切片中血管標本的橫截面積，計算3張切片平均橫截面積，作為該兔的基底動脈管腔面積。

1.2.5 Western blotting檢測eNOS表達 收集對照組、各實驗組基底動脈標本，使用哺乳動物蛋白抽提試劑(RIPA)進行細胞總蛋白提取，應用BCA法測定蛋白含量。每個樣品槽內10μl樣本進行SDS-PAGE電泳，通過電轉印法將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠上轉移NC膜上，轉印后的NC膜用5%脫脂奶粉室溫輕搖30min后加入一抗(濃度1∶500)，室溫輕搖30min后放于4℃過夜，TBS洗膜后加入濃度為1∶2000的二抗(羊抗兔)，室溫輕搖40min，TBS洗膜，ECL顯色液顯色，拍照。

2 結果

2.1 大體標本觀察 對照組腦干腹側基底動脈周圍無血凝塊，實驗組在1d、3d、5d、7d標本基底動脈周圍可見明顯的凝血塊，隨時間的推移，凝血塊的范圍、大小和顏色呈現(xiàn)減退，至第10天，基底動脈周圍凝血塊已經(jīng)基本消失(見圖1、圖2)。

2.2 各組基底動脈橫截面積比較 基底動脈行HE染色后，測定每個切片中血管標本的橫截面積，取得各個實驗組和對照組的基底動脈橫截面積。對照組基底動脈橫截面積為584971.4±80780.1 μm2，SAH 第 1 天為 329441.5 ±15907.5μm2;SAH第3天為 404492.3±73172.1μm2;SAH 第 5 天為300619.6 ±26176.2μm2;SAH 第7 天為242604.7 ±45977.1μm2;SAH 第 10 天為 362157.4 ±38480.7。經(jīng)統(tǒng)計學處理后發(fā)現(xiàn)實驗組基底動脈橫截面積總體小于對照組，與對照組比較有差異(P＜0.05)，SAH第3天、第7天和第10天相比，P＜0.05。

2.3 基底動脈組織學變化 在光鏡下，對照組的血管壁無增厚，內皮細胞結構完整，內彈力膜清晰可見，結構完整。SAH模型組可見血管壁增厚，管腔狹窄，內皮細胞變性、腫脹，染色質不均，空泡形成;內彈力膜迂曲皺褶或斷裂，厚薄不均，平滑肌細胞排列紊亂。這些改變在SAH后第1天開始出現(xiàn)，第3天逐漸明顯，第5天和第7天表現(xiàn)最為明顯，第10天上述改變明顯減輕，內彈力膜皺縮基本消失，內皮細胞排列漸趨平整，內皮細胞稍有腫脹，管徑基本恢復正常(見圖3、圖4)。

2.4 各組兔基底動脈eNOS表達情況 Western blotting觀察到eNOS在對照組大量表達，對照組為1.957322 ±0.028485，SAH 第 1 天為 1.833437 ±0.036424;SAH 第 3 天為 1.389229 ±0.072982;SAH第5天為 1.161714±0.030655;SAH 第 7 天為1.239918±0.027786;SAH 第 10 天為 1.434776 ±0.067526。結果顯示實驗組第1天表達開始減少，第5天表達水平明顯減弱，之后表達逐漸增加，與對照組相比均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(見圖5、圖6)。

圖1 對照組腦干周圍未見蛛網(wǎng)膜下腔出血

圖2 SAH組第5天腦干周圍大量蛛網(wǎng)膜下腔出血

圖3 對照組內皮細胞結構完整，內彈力膜清晰可見，結構完整

圖4 SAH組注血后第5天內皮細胞變性、腫脹，染色質不均空泡形成;內彈力膜迂曲皺褶或斷裂

圖5 各組eNOS表達情況 注:與對照組比較*P＜0.05

圖6 各組eNOS檢測結果

3 討論

蛛網(wǎng)膜下腔出血后約30%～50%患者會出現(xiàn)腦血管痙攣，可導致腦缺血、引起神經(jīng)功能障礙、甚至死亡［3］。腦血管痙攣呈雙相性，一種為早發(fā)性，多見于SAH后0.5h～3d，常于4h內緩解，也稱急性腦血管痙攣;另一種為遲發(fā)性腦血管痙攣(DCVS)，發(fā)生于出血后4～15d，7～10d為高峰期，2～4w逐漸減少。遲發(fā)性腦血管痙攣不同于急性期腦血管痙攣，其一旦發(fā)生，難于逆轉，后果往往較嚴重［4］。然而，關于腦血管痙攣的發(fā)病機制比較復雜，至今尚未完全闡明。目前普遍認為SAH后CVS是由多因素所致，如高分子溶血產(chǎn)物氧合血紅蛋白(OxyHb)的增多、擴血管物質如NO減少、細胞凋亡、血液高凝狀態(tài)、免疫炎癥反應［5］等因素。

本實驗研究結果表明蛛網(wǎng)膜下腔出血后第1天eNOS表達開始減少，第5天減少最嚴重，之后開始慢慢恢復。HE染色提示SAH后第1天開始出現(xiàn)血管壁增厚，管腔狹窄，內皮細胞變性、腫脹，染色質不均，空泡形成;內彈力膜迂曲皺褶或斷裂，厚薄不均，平滑肌細胞排列紊亂;第3天逐漸明顯;第5天和第7天表現(xiàn)最為明顯;第10天上述改變明顯減輕。eNOS的表達與血管壁的病理改變相符。我們認為eNOS與腦血管痙攣可能存在一定的關系，其表達減少可能參與蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的發(fā)展。

eNOS是NO/cGMP信號途徑的關鍵酶，通過與內皮細胞鈣離子和鈣調蛋白相偶聯(lián)而激活，具有調節(jié)血管緊張度和保持內皮細胞功能的作用，可能還有神經(jīng)保護和抗炎癥作用。血管內皮細胞內eNOS催化產(chǎn)生NO釋放后，能迅速進入鄰近的平滑肌細胞，激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(GC)，GC催化產(chǎn)生環(huán)鳥苷酸(cGMP)，cGMP激活細胞內肌質網(wǎng)上鈣泵，使細胞內游離鈣泵入肌質網(wǎng)內，細胞內游離鈣減少，使血管平滑肌處于舒張狀態(tài)［6］。同時cGMP可通過抑制蛋白激酶活性，使血管平滑肌舒張。蛛網(wǎng)膜下腔出血后，NO水平下降，則GC活性降低，cGMP生成不足，從而舒張平滑肌能力減弱。eNOS可能通過解偶聯(lián)作用導致SAH后繼發(fā)腦血管痙攣、微血栓形成，甚至導致神經(jīng)元細胞的死亡［7］。

eNOS合成的NO作為血管調節(jié)因子的同時，還具有維持血管壁幾何形態(tài)的作用，對血管性疾病起到預防作用。研究表明，在eNOS基因敲除的大鼠模型中，由于eNOS缺乏可以導致血管壁囊性膨出，提示eNOS合成的NO作為血管舒張因子的同時，還可以起到維持血管壁結構的作用［8］。SAH時由于血管內皮細胞在毒性作用下結構發(fā)生破壞，使eNOS活性降低，NO的合成減少，NO含量下降，可造成血管痙攣。有學者指出，eNOS基因多態(tài)性可以預測動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血和腦血管痙攣的易感性［9，10］。Pyne-Geithman 等學者研究發(fā)現(xiàn) eNOS 是預測蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的有用指標［11］。許多藥物可能通過調節(jié)eNOS的表達而發(fā)揮減輕腦血管痙攣的作用:雌二醇可能通過保持eNOS的表達水平而發(fā)揮減輕腦血管痙攣的作用［12］;川芎嗪毛冬青(毛披樹)可能通過上調eNOS的表達水平增加NO表達水平從而減輕腦血管痙攣［13］;辛伐他汀通過上調eNOS的磷酸化水平而發(fā)揮減輕腦血管痙攣作用［14］。

綜上所述，eNOS是合成NO的關鍵酶，SAH后痙攣的腦血管壁中eNOS減少，從而進一步證明了NO減少在血管痙攣的發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。繼續(xù)加深對eNOS的研究可能有利于指導臨床腦血管痙攣的防治。

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