楊玉梅， 吳 江， 杜丹華， 高 鵬， 劉進(jìn)香

流行病學(xué)及病因?qū)W研究表明腦梗死是一種性狀復(fù)雜的多基因遺傳病，其發(fā)病過(guò)程中存在基因-基因和基因-環(huán)境的相互作用［1］。動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是腦梗死的主要病因，與脂代謝障礙有關(guān)。本研究選取脂代謝環(huán)路上的脂蛋白脂酶、對(duì)氧磷酶1基因?yàn)楹蜻x基因，在這2個(gè)基因上選擇5個(gè)SNPs位點(diǎn)為遺傳標(biāo)記，應(yīng)用病例-對(duì)照的關(guān)聯(lián)分析方法，探討這兩個(gè)基因間相互作用與腦梗死發(fā)病的相關(guān)性。為腦梗死的早期預(yù)警和針對(duì)基因功能的個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇中國(guó)北方漢族腦梗死患者和排除腦梗死的健康人為研究對(duì)象。其中病例組705人，為2005年10月～2006年6月在吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的腦梗死患者，平均年齡60.9±10.9歲。所有患者均符合1995年中華醫(yī)學(xué)會(huì)第四屆腦血管病會(huì)議修訂的各類腦血管疾病診斷要點(diǎn)，由兩名神經(jīng)科醫(yī)生根據(jù)詳細(xì)的神經(jīng)科檢查、頭部CT和/或MRI掃描確診為腦梗死，并除外潛在的心源性栓子和周圍血管栓塞性疾病者、大動(dòng)脈炎、外傷、血液病、藥物、惡性腫瘤、血管畸形或動(dòng)脈瘤等引起的腦梗死。按TOAST分型標(biāo)準(zhǔn)［2］，分為動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死組(AS)和腔隙性腦梗死(IS)組。對(duì)照組410例，來(lái)自吉林大學(xué)第一醫(yī)院體檢中心同期健康體檢人群，與病例組的年齡、性別相匹配。所有研究對(duì)象均有完整的臨床資料，包括性別、年齡、體重指數(shù)、既往史、吸煙、飲酒史、家族史、血生化指標(biāo)(血糖、血脂)、頭部CT或MRI檢查結(jié)果，部分患者行腦彩超和頸部血管彩超檢查。所有入組病例均簽屬知情同意書(shū)。

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)人類單倍體圖計(jì)劃［3］(Hapmap)提供的漢族人數(shù)據(jù)，選取LPL基因上的2個(gè)SNP(SNP1:rs328及SNP2:rs326)及PON1基因上的 3個(gè)標(biāo)簽 SNP(tagSNP)(SNP3:rs2299262、SNP4:rs854552、SNP5:rs662)為遺傳標(biāo)記，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物。引物序列如下:SNP1:F:5’-TCACATCCATTTTCTTC，R:5’-CACAGTACAGCTTTAGCACAGAATGCTCACCAGACT-3’;SNP2:F5’-AGGCAGATGCCC TAA TTC C-3’，R:5’-CAC CCT GTG GAA GAA AAT GG-3’;SNP3:F:5’ATCCTCAAACACCTCCGTGA-3’，R:5’-AGGCCCAGAACATTTGGACT-3’;SNP4:F:5’-TGGAGTTCTAAAGACACGTGAGC-3’，R:5’-GGGAGTGATATGATGTGTAGGG-3’;SNP5:F:5’-GCACTTTTATGGCACAAATCATCAC-3’，R:5’-TCCATTAGCAAAATCAAAGCC-3’。

1.3 人外周血白細(xì)胞基因組DNA的提取 所有研究對(duì)象均于清晨空腹經(jīng)肘前靜脈取血2ml，肝素抗凝。取300μl用Promega基因組快速提取試劑盒提取基因組DNA。

1.4 基因型檢測(cè) 用PCR-RFLP方法進(jìn)行基因型檢測(cè)。(1)PCR反應(yīng)體系為23μl，其中雙蒸水14.2μl，0.92mmol Tris-HCl(pH8.3)，46mmol KCl，1.5mmol MgCl，4 種 dNTP 各 200μmol，引物各1.5 μmol，Taq DNA 聚合酶 1.0U(Promega，北京)，基因組DNA30～50ng。(2)SNP1位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行HinfⅠ內(nèi)切酶消化;SNP2位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行MspⅠ內(nèi)切酶消化;SNP3位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行ECORⅠ內(nèi)切酶消化;SNP4位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行BstN1內(nèi)切酶消化;SNP5位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行DpnⅡ內(nèi)切酶消化。酶切產(chǎn)物用 2.5%瓊脂糖凝膠電泳(90mmV)50min，在凝膠成像系統(tǒng)(UVP，美國(guó))下觀察結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用擬和優(yōu)度檢驗(yàn)分析病例組和對(duì)照組基因型頻率的分布是否符合Hardy-Weinberg(H-W)平衡;UNPHASED遺傳學(xué)軟件應(yīng)用cocaphase對(duì)等位基因頻率進(jìn)行分析;SPSS15.0軟件包應(yīng)用卡方檢驗(yàn)對(duì)基因型頻率進(jìn)行分析。P＜0.05認(rèn)為差異有顯著性。應(yīng)用等位基因條件分析(conditioning on allele，COA)的方法分析基因的聯(lián)合作用與腦梗死的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料分析 腦梗死組與對(duì)照組間性別、年齡、BMI無(wú)明顯差異。動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死組收縮壓、舒張壓、血糖、甘油三酯與對(duì)照組相比差異有顯著性。腔隙性腦梗死組收縮壓、舒張壓、血糖與對(duì)照組相比差異有顯著性。

2.2 Hardy-Weinberg平衡分析結(jié)果 對(duì)研究對(duì)象的各SNP位點(diǎn)進(jìn)行擬和優(yōu)度檢驗(yàn)，腦梗死組和對(duì)照組基因型分布均未偏離H-W平衡。

2.3 基因型及等位基因頻率比較 腦梗死組與對(duì)照組相比各位點(diǎn)基因型頻率差異無(wú)顯著性，將腦梗死組按TOAST分型標(biāo)準(zhǔn)分為動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死組和腔隙性腦梗死組進(jìn)行亞組分析，仍無(wú)顯著性差異(見(jiàn)表1)。SNP1(rs328)G等位基因頻率在動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死組與對(duì)照組相比差異顯著(χ2=4.83，P=0.034，OR=1.47，95%CI=1.03 ～2.13);SNP2(rs326)G等位基因頻率在動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死組與對(duì)照組相比差異顯著(χ2=3.597，P=0.047，OR=1.64，95%CI=1.12 ～1.84)(見(jiàn)表2)。

2.4 LPL基因與PON1基因多態(tài)聯(lián)合作用與腦梗死的相關(guān)性分析 應(yīng)用等位基因條件分析(conditioning on allele，COA)的方法分析基因的聯(lián)合作用與腦梗死的關(guān)系。在本研究中，以位于8p22上的陽(yáng)性位點(diǎn)rs328為條件，來(lái)分析位于7q21上的rs2299262和rs854552與rs662等位基因的聯(lián)合對(duì)腦梗死的發(fā)病是否具有作用。結(jié)果顯示PON1基因上的rs2299262位點(diǎn)與LPL基因上的rs328聯(lián)合作用與腦梗死的發(fā)病具有相關(guān)性(χ2=6.26，df=2，P=0.043)(見(jiàn)表3)。

表1 各組基因型分布(%)

表2 各組等位基因頻率分布(%)

表3 SNPs聯(lián)合作用的條件檢驗(yàn)結(jié)果

3 討論

遺傳學(xué)研究表明腦梗死屬于多基因遺傳病。多基因性狀或遺傳病的形成，往往是多個(gè)微效基因累加作用的結(jié)果，即其中每種基因的作用相對(duì)較微弱，數(shù)個(gè)基因的迭加作用或基因間的相互作用導(dǎo)致了疾病的發(fā)生。腦梗死作為復(fù)雜性疾病，其發(fā)病過(guò)程中同樣存在基因-基因和基因-環(huán)境的相互作用。已有研究報(bào)道基因與基因間的聯(lián)合作用與腦梗死的發(fā)病存在關(guān)聯(lián)［4～7］?；蜷g的相互作用主要表現(xiàn)為:(1)一個(gè)信息傳導(dǎo)通路上的基因可參與激活或抑制另一條信息傳導(dǎo)通路;(2)兩種不同的信息傳導(dǎo)通路可共同作用于同一基因調(diào)控區(qū)而協(xié)同發(fā)揮作用;(3)同一基因可作用于幾條信息傳導(dǎo)通路。

3.1 LPL基因多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性 由于LPL基因變異可能影響血脂水平和血管功能，從而影響個(gè)體對(duì)缺血性心、腦血管病的易感性，所以國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者都進(jìn)行過(guò)LPL基因與腦血管病的相關(guān)性研究。我們的研究發(fā)現(xiàn)LPL基因rs328、rs326位點(diǎn)G等位基因分布在動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死組與對(duì)照組差異顯著，推測(cè)它們可能與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)病相關(guān)［8，9］。

3.2 PON1基因多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性對(duì)氧磷酶1(PON1)基因有多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其突變可造成相應(yīng)酶活性的改變，在動(dòng)脈粥樣硬化的形成中起重要作用［10］，故推測(cè)其可能影響缺血性腦卒中的發(fā)生。我們的研究未發(fā)現(xiàn)PON1基因的4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與腦梗死的發(fā)病相關(guān)［11］。

3.3 基因聯(lián)合作用與腦梗死發(fā)病的相關(guān)性本研究所選的5個(gè)SNP位點(diǎn)位于兩條不同的染色體上，我們應(yīng)用等位基因條件分析的方法分析基因的聯(lián)合作用與腦梗死的關(guān)系。該方法分析的優(yōu)點(diǎn)是檢驗(yàn)效力強(qiáng)，可研究不同染色體上的基因位點(diǎn)之間的聯(lián)合作用，闡明相互作用的多個(gè)位點(diǎn)與腦梗死發(fā)病的關(guān)聯(lián)性。本研究中以位于8p22上的陽(yáng)性位點(diǎn)rs328為條件，來(lái)分析位于7q21上的rs2299262和rs854552與rs662等位基因的聯(lián)合對(duì)腦梗死的發(fā)病是否具有作用。結(jié)果顯示PON1基因上的rs2299262位點(diǎn)與LPL基因上的rs328聯(lián)合作用與腦梗死的發(fā)病具有相關(guān)性(χ2=6.26，df=2，P=0.043)。我們考慮如下:(1)我們前面的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)rs328位點(diǎn)多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)生相關(guān)［8］，推測(cè)該多態(tài)性促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，斑塊形成及繼發(fā)的炎癥反應(yīng)過(guò)程中釋放的細(xì)胞因子可能引起PON1基因表達(dá)的變化，影響了循環(huán)中PON1的活性，促進(jìn)了腦梗死的發(fā)生;(2)PON1基因臨近烯醇式丙酮酸脫氫酶激酶基因，說(shuō)明PON1基因與糖代謝基因連鎖。而rs328多態(tài)性可能與高血糖者發(fā)生腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，推測(cè)rs2299262位點(diǎn)與糖代謝基因的相互作用擴(kuò)大了rs328多態(tài)性的效應(yīng)。但上述假設(shè)尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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