胡躍強(qiáng)， 唐 農(nóng)， 董少龍， 畢方方， 祝美珍， 胡玉英， 陳 煒

腦缺血預(yù)處理(brain ischemic preconditioning，BIP)是近年發(fā)現(xiàn)的重要內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，可使腦組織對以后較長時間的缺血性損傷產(chǎn)生顯著的耐受。最近有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)在此環(huán)節(jié)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其中PKR樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)介導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)信號通路頗為重要，激活轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)是 PERK通路中的重要組成物質(zhì)。

本研究意在通過檢測局灶性BIP后ATF4 mRNA及其蛋白在腦內(nèi)的表達(dá)變化，以進(jìn)一步研究BIP的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處理 健康雄性SD大鼠120只，體重250±50g，隨機(jī)將大鼠分為3組:假手術(shù)組(sham-operation，SO)、大腦中動脈缺血組(middle cerebral artery occlusion，MCAO)、腦缺血預(yù)處理組(BIP)。每組按照再缺血后12h、1d、2d、3d 4 個時間點(diǎn)平均分為4個亞組(n=10)分別作如下處理:SO組:以假手術(shù)代替預(yù)缺血及缺血再灌注;MCAO組:以假手術(shù)代替預(yù)缺血，其余步驟同BIP組;BIP組:MCAO 10min后抽出栓線，完成預(yù)缺血，3d后再次行MCAO 2h，再灌注后 12h、1d、2d、3d 處死大鼠。

1.2 動物模型及標(biāo)本制備 參照Longa的線栓法進(jìn)行造模。采用大腦中動脈二次線栓法［1］制備大鼠腦缺血預(yù)處理模型，結(jié)扎大鼠左頸外動脈遠(yuǎn)端和頸總動脈近端，將前端用火焰燒圓的尼龍線從頸總動脈殘端插入，進(jìn)線約18～20mm，MCAO后10min抽出線栓，完成預(yù)缺血。3d后再次行MCAO 2h，再灌注后按規(guī)定時間點(diǎn)處死動物取腦。

1.3 缺血半暗帶腦皮質(zhì)ATF4mRNA表達(dá)測定

原位雜交法。按試劑盒說明進(jìn)行操作。采用HMIAS-2000高清晰彩色病理圖像分析系統(tǒng)測定ATF4 mRNA原位雜交染色的灰度值，平均灰度值在圖像分析中用來表示圖像的透光率，最亮為255級，最黑為0級，平均灰度值越高，說明原位雜交染色越淺，mRNA表達(dá)越少。主要就頂葉缺血半暗帶陽性細(xì)胞做比較，每張切片測定4個視野(×400)，取平均值。

1.4 缺血半暗帶腦皮質(zhì)內(nèi)ATF4蛋白表達(dá)測定 大鼠迅速斷頭取腦，冰上分離缺血側(cè)頂葉大腦皮質(zhì)約100mg，冰上研磨組織后加預(yù)冷的蛋白裂解液，繼續(xù)碾磨至液態(tài)，然后4℃、12000r/min離心30min，留上清液，取40μl用BCA法進(jìn)行蛋白定量測定，所剩上清液按4∶1的比例加變性5×上樣緩沖液，100℃ 水浴10min。取蛋白樣品(40μg)采用10%SDS-PAGE垂直電泳(Bio-Rad，USA)進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(PVDF)上進(jìn)行免疫反應(yīng)。5%脫脂奶粉37℃封閉2h，然后依次加入兔抗ATF4抗體(美國ABcam公司，1∶1000)，37℃ 孵育2h，4℃過夜;偶聯(lián)有辣根過氧化物(HRP)的羊抗兔IgG(美國Amersham公司，1∶2000)室溫孵育2h，加入LumiGLO(20×)發(fā)光劑在X-感光盒內(nèi)曝光。以上反應(yīng)均在塑料袋內(nèi)進(jìn)行，其間用PBS充分洗滌。將膠片進(jìn)行掃描或拍照，采用HMIAS-2000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，獲取各組Western blot條帶的平均光密度(OD)值，內(nèi)參為GAPDH，目的蛋白與內(nèi)參光密度比值即為目的蛋白的相對值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，P＜0.05示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 ATF4 mRNA表達(dá)變化 原位雜交顯示:SO組有少量ATF4 mRNA表達(dá);MCAO組大鼠腦缺血再灌注后12h頂葉皮質(zhì)缺血半暗帶ATF4 mRNA表達(dá)達(dá)高峰(P＜0.01)，隨再灌注時間延長其表達(dá)逐漸下降，但仍保持較高表達(dá)水平(P＜0.01);BIP組缺血后各時間點(diǎn)其表達(dá)水平較MCAO組均明顯下降(P ＜0.05)(見表1、圖1)。

2.2 ATF4蛋白表達(dá)的變化 Western blot顯示:SO組大鼠有少量ATF4蛋白表達(dá);MCAO組12h頂葉皮質(zhì)缺血半暗帶ATF4蛋白表達(dá)達(dá)高峰(P＜0.01)，隨再灌注時間延長其表達(dá)逐漸下降，但仍保持較高表達(dá)水平(P＜0.01);BIP組缺血各時間點(diǎn)其表達(dá)水平較MCAO組均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)(見表2、圖2)。

表1 大鼠頂葉皮質(zhì)ATF4 mRNA表達(dá)的變化±s，灰度值)ATF4 mRNA 表達(dá)

表1 大鼠頂葉皮質(zhì)ATF4 mRNA表達(dá)的變化±s，灰度值)ATF4 mRNA 表達(dá)

與SO組比較#P＜0.01;與MCAO組同時間點(diǎn)比較*P＜0.05

組別12h 24h 2d 3d SO組MCAO組BIP組186.32 ±12.69123.53 ±9.21#135.67 ±8.74*191.59 ±11.58134.81 ±10.43#148.55 ±8.86*190.80 ±12.76145.48 ±10.15#159.24 ±9.76*188.76 ±12.27153.35 ±11.05#167.89 ±8.78*

表2 大鼠頂葉皮質(zhì)ATF4蛋白表達(dá)的變化±s，OD值)ATF4蛋白表達(dá)

表2 大鼠頂葉皮質(zhì)ATF4蛋白表達(dá)的變化±s，OD值)ATF4蛋白表達(dá)

與SO 組比較#P ＜0.01;與 MCAO組同時間點(diǎn)比較*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別12h 24h 2d 3d SO組MCAO組BIP組0.823 ±0.0721.624 ±0.129#1.497 ±0.123*0.830 ±0.0751.507 ±0.116#1.389 ±0.105*0.826 ±0.0681.468 ±0.122#1.231 ±0.110＊＊0.834 ±0.0701.325 ±0.113#1.102 ±0.984＊＊

圖1 各組2d時ATF4 mRNA的表達(dá)(原位雜交，×400)

圖2 各組1d時ATF4蛋白的表達(dá)(Western blot)

3 討論

腦缺血預(yù)處理(BIP)是指對腦組織采用機(jī)械刺激，如一次或多次短暫性腦缺血再灌注后，誘導(dǎo)腦組織產(chǎn)生內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，使其對以后較長時間的缺血性損傷產(chǎn)生顯著的耐受，這種現(xiàn)象又稱為腦缺血耐受。最近有研究發(fā)現(xiàn)［2］BIP可激發(fā)適當(dāng)?shù)膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)，增強(qiáng)細(xì)胞耐受后繼長時間缺血刺激的能力，延緩或減輕I/R造成的組織損傷，并認(rèn)為ERS可能是腦缺血細(xì)胞損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。ERS激活未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)是引起凋亡的重要因素，存在顯著UPR的神經(jīng)元后來出現(xiàn)凋亡，但機(jī)制尚未完全闡明?，F(xiàn)已知哺乳動物的UPR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)形成了3條互相聯(lián)系的通路，其中PERK介導(dǎo)的UPR信號通路頗為重要，因為該基因與GRP78解離后活化而引起的eIF2a磷酸化可直接誘發(fā)蛋白質(zhì)合成抑制［3］，并可誘導(dǎo)ATF4等UPR靶基因在缺血后表達(dá)［4］，ATF4能結(jié)合ATF/CRE元件序列和氨基酸反應(yīng)元件的核心序列，調(diào)節(jié) CHOP［5］和 ATF3 等的［6］表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有關(guān)腦缺血動物模型中ATF4表達(dá)的研究國內(nèi)外甚少報道。

Li［7］等制作大鼠MCAO模型，發(fā)現(xiàn)再灌注1h在缺血周邊區(qū)可檢出ATF4免疫陽性細(xì)胞，再灌注24h達(dá)高峰;Rissanen［8］等報道大鼠MCAO模型自發(fā)性恢復(fù)期間UPR基因的表達(dá)情況，該研究將手術(shù)組和假手術(shù)組動物再分為術(shù)后2d、7d、14d、28d等亞組，用原位雜交技術(shù)檢測相關(guān)基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)手術(shù)組和假手術(shù)組各亞組大鼠不同腦區(qū)ATF4基因表達(dá)水平無顯著性差異。上述研究表明ATF4表達(dá)僅在缺血再灌注后一定時間范圍內(nèi)有明顯變化。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血120min再灌注12h缺血側(cè)頂葉皮質(zhì)ATF4 mRNA及其蛋白表達(dá)即達(dá)高峰，隨再灌注時間延長其表達(dá)逐漸下降，再灌注72h仍可見其高表達(dá)，提示大鼠缺血再灌注損傷誘發(fā)的ERS可誘導(dǎo)ATF4的表達(dá)，與相關(guān)研究報道基本一致［7］。而BIP干預(yù)后其表達(dá)均有明顯的下降，提示BIP可能通過影響ERS后ATF4的表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。其機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

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