朱 揚， 張兆輝， 曾 偉， 高 延， 許澤武， 徐金梅

星形膠質(zhì)細胞是腦組織中含量最多的一種細胞。近來研究發(fā)現(xiàn)正常生理條件下，星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元起營養(yǎng)、支持和保護作用，而腦損傷可激發(fā)星形膠質(zhì)細胞使其過度活化，釋放大量細胞因子，損傷神經(jīng)元，同時過度增殖的膠質(zhì)細胞形成膠質(zhì)瘢痕阻礙了損傷后的修復以及神經(jīng)元軸突再生，并明顯改變了局部正常結(jié)構及神經(jīng)元的生存環(huán)境。溶血磷脂酸是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞間磷脂類信號分子，是細胞存活、增殖及遷移的強有力的誘導因子。在急性缺血性心腦血管病、腦損傷時，血小板被凝血酶活化產(chǎn)生LPA并釋放到血清中，致使血清LPA水平大幅度增高，進而促進血腦屏障開放，引起神經(jīng)元凋亡、壞死等多種損傷［1，2］，嚴重影響腦血管疾病的預后。而LPA受體主要在AST中表達，AST為LPA在腦內(nèi)作用的主要靶細胞［3］。

因此，LPA與AST活化增殖的內(nèi)在關系已開始引起部分學者的關注。近年大量離體實驗研究發(fā)現(xiàn)LPA能誘導AST增殖，但目前國內(nèi)外相關在體研究較少，而有關海馬區(qū)域相關研究尚未見報道。

故本實驗擬通過觀察LPA對在體海馬AST的影響，從在體水平證實LPA誘導海馬AST增殖并探討其可能的作用機制，為急性缺血性腦血管病、腦損傷的理論及治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 立體定向儀、微量注射器、光學顯微鏡及手術器械等，溶血磷脂酸(Sigma公司)，U0126(Promega公司);小鼠來源磷酸化ERK1/2一抗、羅丹明標記羊抗小鼠IgG、FITC標記羊抗小鼠IgG、封閉用山羊血清(Santa Cruz公司);小鼠來源膠原纖維酸性蛋白一抗(Neo markers公司);封閉用小鼠血清(Boster公司);振蕩切片機，德國Leica公司產(chǎn)品;TCSSP2 AOBSMP型激光共聚焦顯微鏡，德國Leica公司產(chǎn)品。

1.2 實驗動物及分組 80只健康雄性SD大鼠，月齡2～3個月，體重200±25g，購于武漢大學醫(yī)學院實驗動物中心，并隨機分空白對照組5只、實驗對照組25只、LPA組25只、LPA+U0126組25只，其中實驗對照組、LPA組和LPA+U0126組分別于注射 PBS、LPA、LPA+U0126 后1d、3d、5d、7d、14d后處死，每個時間點5只?？瞻讓φ战M不注射藥物，直接處死。

1.3 動物模型的制作 大鼠稱重，20%烏拉坦5ml/kg腹腔注射麻醉，固定于立體定位儀上，取前囟右側(cè)2.15mm，后3.00mm處用牙科鉆鉆孔，骨孔直徑約1.0mm，自顱骨表面垂直進針3.00mm深;P組、L組、L+U組分別用緩慢注射推進器注射PBS5μl和50μmol LPA5μl以及 U0126和 LPA 混合液5μl(0.2μl/min)，注射完畢后針頭在腦內(nèi)停留10min，緩慢退出。

1.4 切片制備 各組大鼠分別于術后不同時間點開胸，用4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(PBS，pH=7.4)300ml進行心臟灌注，灌注完后取腦置于4%多聚甲醛中固定24h。沖洗腦組織，用振蕩切片機在含海馬區(qū)的腦組織連續(xù)冠狀切片(FREE=5，F(xiàn)REQ=5)，片厚50μm。

1.5 免疫熒光雙標記染色 切片置于多聚賴氨酸包被的玻片上，加入封閉液1，置37℃濕盒中1h;滴加1∶300的小鼠GFAP單克隆抗體，置4℃冰箱中過夜;滴加1∶100Rodamin標記羊抗小鼠IgG熒光二抗，置37℃濕盒1h;加入封閉液2，置37℃濕盒中1h;滴加1∶100小鼠 p-ERK單克隆抗體，置4℃濕盒中過夜;滴加1∶100FITC標記羊抗小鼠IgG熒光二抗，置37℃濕盒中1h;甘油封固，加蓋蓋玻片。采用TCSSP2 AOBSMP型激光共聚焦顯微鏡檢查。用單位面積平均熒光強度(Average FI)表示GFAP和p-ERK1/2表達水平。計算公式如下:Average FI=FI/area(μm2)×100000。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差±s)表示，各組間比較采用t檢驗分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。分析結(jié)果用Excel辦公軟件制成圖表。

2 結(jié)果

2.1 各組GFAP熒光強度時程變化 空白對照組與實驗對照組GFAP單位面積平均熒光強度(Average FI)相當，無顯著差異(P＞0.05);LPA注射后第3天，可見GFAP顯著增加(約4倍于基礎強度)，此后隨時間延長，GFAP熒光強度逐漸增加，至LPA注射后2w仍可見增加說明星形膠質(zhì)細胞增殖時間至少持續(xù)2w。U0126與LPA混合液注射后，GFAP單位面積平均熒光強度輕度增加(約2倍于基礎水平)，與實驗對照組無顯著差異(P＞0.05)(見表1)。

表1 不同時間大鼠海馬區(qū)GFAP單位面積熒光強度(Average FI)值比較±s)

表1 不同時間大鼠海馬區(qū)GFAP單位面積熒光強度(Average FI)值比較±s)

與實驗對照組比較*P ＜0.05，#P ＜0.01;與 LPA+U0126組比較△P ＜0.05

GFAP組別 鼠數(shù)(只)單位面積熒光強度1d 3d 5d 7d 14d空白對照組實驗對照組LPA組LPA+U0126組526.95 ±0.49117.27 ±1.24＊△65.34 ±1.1825252521.28 ±0.1920.00 ±0.4552.35 ±1.0934.82 ±0.5619.41 ±0.2679.00 ±0.79＊△49.15 ±0.7323.00 ±0.3491.14 ±1.12#△58.76 ±0.8424.00 ±0.1698.14 ±0.98＊△59.35 ±1.03

2.2 各組p-ERK磷酸化熒光強度變化 LPA注射后第5天誘導顯著的ERK 1/2磷酸化反應，第7d增加到最高水平，后出現(xiàn)輕度下降，基本與GFAP熒光強度平行增長(見圖1)，與實驗對照組有顯著差異(P＜0.05)。LPA+U0126注射后各個時間點均未見明顯的p-ERK1/2表達，但GFAP仍出現(xiàn)輕度的表達增加(見表1)，提示U0126能完全阻斷LPA誘導的ERK1/2磷酸化，但只部分抑制AST增殖(見圖1)。

2.3 LPA誘導的p-ERK表達在腦組織中的定位 在雙標檢測中，早期在GFAP陽性細胞中LPA誘導的p-ERK1/2未見明顯的表達，而在注射部位的神經(jīng)元分布區(qū)有顯著的表達(見圖2A～C)。繼續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，注射后第14天在GFAP陽性細胞中有p-ERK1/2強烈的表達，且?guī)缀跞吭谠摷毎斜磉_(見圖2D)，提示LPA誘導的ERK1/2磷酸化早期主要在神經(jīng)元和其他細胞中表達，后期主要在AST中表達。

圖1 L組GFAP和p-ERK1/2熒光強度時程變化

3 討論

LPA是上世紀60年代發(fā)現(xiàn)并開始研究的一種細胞膜脂類衍生物，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷部位出現(xiàn)最早的信號分子之一，它作為一種脂質(zhì)生長因子因其具有強烈的促增殖效應而引起人們的廣泛關注。LPA具有促血小板聚集、平滑肌收縮、細胞增殖、增加緊密連接的通透性、促進細胞凋亡、壞死等多種生物學效應，在中樞系統(tǒng)損傷性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

星形膠質(zhì)細胞增生(Astrocyte proliferation)是許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展過程中常見的病理改變。近年來研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞增生進而形成膠質(zhì)瘢痕在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、變性性疾病以及癲癇中起著重要的作用［4］。而國內(nèi)外大量研究證實LPA的一個重要功能就是其能誘導多片腦區(qū)AST細胞增殖［5，6］，但關于 LPA 引起 AST 增殖的研究目前大多局限于細胞學水平，對于LPA誘導AST增殖的在體研究較少。Sorensen等［7］人的在體研究顯示，LPA能誘導大鼠紋狀體AST增殖。GFAP是特異性存在于AST中的中間絲，可用于標記損傷后膠質(zhì)反應，其陽性表達提示星形膠質(zhì)細胞的存在。本研究通過50μm LPA定位注射后發(fā)現(xiàn)大鼠海馬區(qū)GFAP陽性細胞數(shù)目明顯增多，隨時間延長，GFAP陽性表達細胞數(shù)逐漸增加，至少持續(xù)2w仍在快速增加。此結(jié)果提示LPA可以誘導大鼠海馬區(qū)AST增殖，這與細胞學研究結(jié)論相符，并首次在在體研究中證實之。但LPA作用途徑十分復雜，其促AST增殖機制尚不完全明了。

我們認為在急性缺血性心腦血管病、腦出血、腦挫傷等疾病發(fā)生時出現(xiàn)血漿LPA大量增加，導致神經(jīng)元多種損傷，同時誘導AST大量增殖，形成膠質(zhì)瘢痕阻礙神經(jīng)元損傷后的修復以及其軸突再生，進一步加重了神經(jīng)元細胞的損害。因此尋找一種有效的手段及時遏止AST的大量增殖可以有效地保護神經(jīng)元，減輕其不可逆損傷，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病的臨床治療上有著重要意義。目前研究已知LPA主要通過質(zhì)膜上的G蛋白偶聯(lián)受體LPA1、LPA2、LPA3和LPA4發(fā)揮生物學功能，與LPA受體耦聯(lián)的主要有3種 G蛋白，即 Gi/o、Gq/11和 G12/13。Yart等人［8］的研究表明LPA可以通過與 LPA1耦聯(lián)的Gi蛋白活化絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途徑實現(xiàn)細胞增殖，另有文獻報道LPA通過與LPA3耦聯(lián)的Gq蛋白調(diào)節(jié)細胞內(nèi)［Ca2+］濃度，最終激活 MAPK途徑實現(xiàn)細胞增殖［9］。而ERK1/2作為 MAPK家族的重要成員之一，廣泛存在于整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在介導細胞反應的信號系統(tǒng)中起著重要作用。ERK1/2激活后可磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子和其他蛋白激酶等多種底物，參與多種細胞的增殖、分化以及凋亡等細胞行為［10］。U0126為蛋白激酶阻滯劑，可以特異性阻斷ERK1/2信號途徑，抑制MAPKS級聯(lián)反應，參與細胞周期調(diào)控［11］。LPA對AST的增殖效應能被U0126阻斷，證明LPA可以通過p-ERK1/2誘導AST的增殖。

但在我們的實驗中觀察到LPA對AST的增殖效應沒有被U0126完全阻斷，注射U0126與LPA混合液的部位GFAP陽性細胞數(shù)目仍有少量增加。同時在雙標檢測中我們還發(fā)現(xiàn)早期(＜7d)主要在神經(jīng)元分布區(qū)域而非AST分布區(qū)域大量表達，繼續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)p-ERK后期(14d)幾乎完全在AST表達。近年來有些學者認為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞之間通過緊密連接等連接方式存在著廣泛的聯(lián)系從而構成細胞之間信息交流的基礎［12］，因我們推測，本實驗中觀察到的LPA誘導的ERK1/2磷酸化細胞分布的變化可能是AST的激活繼發(fā)于其他細胞的激活的結(jié)果，也許是在體條件下LPA誘導AST增殖的另一途徑，因而解釋了U0126只能部分阻斷AST的增殖這一現(xiàn)象。

我們的研究結(jié)果顯示LPA可通過磷酸化ERK1/2誘導AST增殖，這為臨床上尋找抑制急性缺血性腦血管病、腦損傷引發(fā)LPA的釋放導致膠質(zhì)細胞過度增生的治療提供了可能的藥物作用靶點。ERK抑制劑U0126的應用提示在LPA誘導大鼠海馬AST增殖中，除了有MAPK/ERK1/2信號轉(zhuǎn)導通路的參與外，還可能存在其他信號轉(zhuǎn)導通路的參與，這還有待進一步的研究證實。

圖2 GFAP和p-ERK1/2雙標圖(免疫熒光雙標記法)

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