洪學敏，周巧玲，唐 榮，何 楠，劉抗寒，楊敬華

（中南大學湘雅醫(yī)院 腎內科，湖南 長沙 410008）

有關資料顯示，近年來急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）的發(fā)生率呈逐年升高趨勢[1-3]。由于臨床上缺乏可靠的早期腎損傷的診斷指標及除透析以外的有效治療措施，其結果導致一部分AKI患者發(fā)展為多器官功能衰竭而死亡，另部分患者發(fā)展成為終末期腎臟疾病[4-6]。因此，早期發(fā)現和治療AKI十分重要。本研究通過抗霉素A誘導的體外缺血再灌注（ischemia-reperfusion injury，IR）損傷模型，觀察體外發(fā)生AKI時腎損傷分子-1（kidney injury molecule-1，Kim-1）及NO水平的變化，并采用冬蟲夏草制劑進行干預實驗，旨在為進一步尋找早期診斷AKI的指標和積極治療AKI提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM培養(yǎng)液（ScholarBio公司），胎牛血清（Medigenetic公司），抗霉素A（Sigma公司），Annexin V/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒（晶美生物科技有限公司），NO試劑盒（南京建成生物科技有限公司），Kim-1 ELISA試劑盒（美國ADL公司），逆轉錄（RT）試劑盒（東洋紡上海生物科技有限公司），冬蟲夏草原液（蟲草制劑）由杭州中美華東制藥有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 腎小管上皮細胞的培養(yǎng) 正常大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E，由中山大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎臟病研究所余學清教授惠贈，源于美國ATCC細胞庫），在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5% 二氧化碳條件下培養(yǎng)。

1.2.2 NRK-52E細胞活性測定（MTT法） 用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔4×104個細胞接種到96孔板，每孔總體積200μL，置37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。在不同時間點（24、48和72 h）加入蟲草制劑干預，每孔加MTT溶液（5 mg/mL用PBS配）20μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液。每孔加150μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分融解。選擇490 nm波長，在酶聯免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值（A值）。

1.2.3 實驗分組 將第5代NRK-52E培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)（37℃含5% 二氧化碳），待細胞生長至80%融合，無血清同步12 h后加入干預藥物進行實驗。設對照組（PBS）、模型組（抗霉素A）以及蟲草干預組（蟲草制劑）。設6個時間點：模型制備前（0/0 min）、抗霉素A干預終點（60/0 min）、恢復培養(yǎng)液培養(yǎng)后 10 min（60/10 min）、恢復培養(yǎng)液培養(yǎng)后30 min（60/30 min）、恢復培養(yǎng)液培養(yǎng)后60 min（60/60 min）、恢復培養(yǎng)液培養(yǎng)后120 min（60/120 min）進行實驗觀察。

1.2.4 體外缺血再灌注模型制備 將第5代NRK-52E培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)（37℃含5% 二氧化碳），待細胞生長至80%融合，無血清同步12 h后進行各組實驗。先去除含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，溫PBS洗兩次，換上含10-10mol/L抗霉素A，1.5 mmol/L CaCl2和2 mmol/L MgCl2的PBS，在5% 二氧化碳，37℃條件下孵育60 min，60 min后更換含10%胎牛血清培養(yǎng)液，模擬體內再灌注過程。同時設立對照組，以不含抗霉素A的含1.5 mmol/L CaCl2和2 mmol/L MgCl2的PBS培養(yǎng)60 min作為對照組，而后用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。用流式細胞儀檢測二組實驗前和再灌注60 min時的細胞凋亡率。

1.2.5 AnnexinV/PI染色流式細胞儀檢測NRK-52E細胞凋亡 參照AnnexinV/PI染色凋亡檢測試劑盒操作步驟進行，0.25%胰酶（不含EDTA）消化細胞成懸液后，1 000 r/min離心5 min，再以預冷的PBS洗滌細胞。重復離心1遍后，用1×Annexin V binding buffer懸浮細胞，調節(jié)其濃度為1×106/mL；取 100μL上述液體（1×105個細胞）置于 5 mL 試管；加 Annexin V-FITC、PI各 5μL，輕柔振蕩細胞，室溫下（25℃）避光孵育15 min；每管再加400μL 1×Annexin V binding buffer，1 h 內上機檢測。Annexin-V+PI-被認為是早期凋亡細胞，Annexin-V+PI+是晚期凋亡細胞。Annexin-V-PI+為壞死細胞，Annexin-V-PI-為活細胞。細胞凋亡率=早期凋亡細胞數／所測細胞總數×100%。

1.2.6 細胞培養(yǎng)液上清NO的檢測 收集兩組不同實驗時間的細胞培養(yǎng)液至離心管中，3 500 r/min離心15 min，-80℃凍存待測。嚴格按試劑盒說明操作，采用550 nm，0.5 cm光徑，測各管的吸光度。并按試劑盒公式計算數值。

1.2.7 細胞培養(yǎng)液上清中Kim-1的檢測（ELISA）同上收集細胞培養(yǎng)液上清樣本。按ELISA試劑盒說明，依次按濃度次序分別加入50μL的標準品于空白微孔中。分別標記樣品編號和空白孔，每組設5個復孔，嚴格按ELISA試劑盒說明進行操作，終止反應后，在450 nm的酶標儀上讀取各孔的OD值，以OD值為縱坐標，以標準品的濃度為橫坐標繪制標準曲線，根據樣品的OD值計算濃度值。

1.2.8 RT-PCR檢測Kim-1 mRNA表達 采用Trizol一步法提取各組細胞RNA，測試管中分別加入引物 Kim-1（373 bp）：上游 5'-GGAGGAAATCTA GGTGTAG-3'，下游 5'-ATCTGGGTCCTTGCTCAG-3'；GAPDH（133 bp）：上游 5'-GACAACTTTGGCATCGTG GA-3'，下游 5'-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3'。按反應條件進行擴增：95℃預變性5 min，94℃變性40 s，54℃退火 35 s，72℃延伸 25 s，72℃終末延伸 7 min，共35循環(huán)，電泳后紫外燈下觀察結果。mRNA半定量分析：將電泳后的凝膠放于Bandscan 510圖像處理系統測量各自產物的光密度，讀出Kim-1mRNA的相對值，進行統計學處理。

1.3 統計學處理

所有研究數據均采用SPSS 10.5軟件包進行統計學處理，計量資料結果用均數士標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）及LSD-t檢驗，相關性采用Pearson直線相關性分析。以P＜0.05時認為差異有顯著性。

2 結果

2.1 冬蟲夏草制劑對NRK-52E細胞增殖的影響

預實驗結果表1顯示，5、10、20和40 mg/L冬蟲夏草制劑對NRK-52E細胞增殖具有促進作用，其中以40 mg/L組尤為明顯；而80 mg/L組開始NRK-52E細胞增殖率下降；從干預時間上看，在同一冬蟲夏草制劑濃度干預實驗時，72 h組較24 h與48 h組NRK-52E細胞增殖率高（均P＜0.05）。因此，本組研究選擇40 mg/L冬蟲夏草制劑和NRK-52E培養(yǎng)72 h為適宜的藥物干預濃度及時間觀察點。

表1 各組NRK-52E細胞增殖情況

2.2 各組NRK-52E細胞凋亡情況

圖1顯示，與對照組比較，各時間段和5種不同劑量蟲草制劑組模型組的NRK-52E細胞凋亡率均顯著升高，其中再灌注10 min時，NRK-52E細胞凋亡率即升高20.96%，隨著再灌注時間延長，細胞凋亡更為明顯，如再灌注1 h時細胞凋亡率為36.58%，再灌注2 h時46.73%。說明抗霉素A能成功誘導NRK-52E出現缺血再灌注損傷，在損傷過程中出現了明顯的細胞凋亡，NRK-52E細胞凋亡率與再灌注時間呈一定的時間依賴性（均P＜0.05）。與模型組比較，蟲草組NRK-52E細胞凋亡明顯減少，且以再灌注30 min、1 h、2 h這3個時間點最為顯著（均P＜0.05）。

2.3 各組NRK-52E細胞Kim-1水平的變化

表2結果顯示，與對照組比較，模型組在缺血60 min時即出現Kim-1濃度顯著增高，是缺血前的3.1倍，再灌注10 min時，Kim-1濃度逐漸增加，是缺血前的3.6倍，并隨再灌注時間延長其濃度進行性增加，當再灌注2 h時是缺血前的4.8倍，各組間均差異有顯著性（均P＜0.05）。而蟲草組與模型組之間比較，無論在細胞缺血開始時還是再灌注10～120 min，各組Kim-1濃度在均較模型組低，兩組之間差異有顯著性（均P＜0.05）。

圖1 各組NRK-52E細胞凋亡率 （n=5）

表2 不同時間點各組NRK-52E缺血再灌注時Kim-1水平的變化 （pmol/L，n=5）

表3 冬蟲夏草對NRK-52E缺血再灌注時NO濃度的影響 （μmol/L，n=5）

2.4 各組NRK-52E細胞Kim-1 mRNA的變化

與對照組比較，模型組各時間點Kim-1 mRNA表達均明顯上調（均P＜0.05）。與模型組比較，蟲草組 Kim-1 mRNA 在再灌注 30 min、60 min、120 min時表達降低，且各個時間點差異有顯著性（均P＜0.05），見圖 2。

圖2 各組NRK-52E細胞Kim-1 mRNA的表達 （n=5）

2.5 各組NRK-52E細胞NO濃度變化

與對照組比較，經抗霉素A組處理后，細胞培養(yǎng)上清中的NO濃度與缺血前比較，缺血60 min增加了大約2.04倍，再灌注10、30和60 min時，NO濃度較缺血前分別增加了2.3、2.8和3.2倍（均P＜0.05），當再灌注120 min NO含量出現了急劇下降，與對照組比較差異無顯著性。與模型組比較，蟲草組NO濃度較缺血前明顯下降（均P＜0.05），見表3。

2.6 相關性分析

相關性分析顯示，在NRK-52E細胞凋亡率升高的同時伴隨Kim-1蛋白的高表達，且二者呈直線正相關（r=0.804，P＜0.01）。在 NRK-52E 細胞凋亡率明顯升高的同時，NO濃度也顯著升高，二者亦呈直線正相關（r=0.633，P＜0.05）。

3 討論

Kim-1是一種新的Ⅰ型跨膜蛋白，它屬于免疫球蛋白Ig基因超家族成員，主要在缺血及腎毒性損傷誘導時腎小管上皮細胞呈持續(xù)高表達，而在正常腎組織中僅有微弱表達[7-9]。本組實驗中，經抗霉素A阻斷細胞呼吸鏈誘導NRK-52E缺血，然后恢復普通培養(yǎng)基培養(yǎng)造成再灌注損傷時，NRK-52E出現明顯的細胞凋亡，細胞上清液Kim-1濃度升高同時Kim-1 mRNA表達增強，且隨再灌注時間延長Kim-1 mRNA表達逐漸增強，呈時間依賴關系。VAIDYA等[10]在缺血再灌注大鼠模型研究中發(fā)現，在雙側腎缺血10 min再灌注24 h即發(fā)現尿中Kim-1水平較基礎控制水平增長了10倍，而且隨著缺血時間延長，Kim-1表達持續(xù)增高，45 min組達到50倍；相比之下，同實驗組大鼠血肌酐、尿素氮、尿蛋白排泄僅在缺血30 min、45 min時才有明顯升高和肌酐清除率下降。他們認為高水平的Kim-1對于早期腎損傷的敏感性明顯優(yōu)于血肌酐、尿素氮、尿微量蛋白、尿NAG酶等傳統診斷指標。此外，LIANGOS等[11]觀察103例人的心肺手術后情況發(fā)現，31.00%的患者發(fā)生了AKI，這些確診AKI病例患者的尿Kim-1濃度在術后2 h即增長了40.00%，術后24 h增長到100.00%，而血肌酐升高50.00%往往發(fā)生在術后1～3 d。另有學者[12]用免疫組化的方法，檢測6例被腎活檢證實腎小管壞死（ATN）患者的腎組織中Kim-1表達狀態(tài)，同時還收集了32例患有急、慢性腎臟病患者的尿液，用ELISA試劑盒檢測尿Kim-1的濃度。其結果發(fā)現，6例腎活檢證實ATN的患者近端腎小管上皮細胞有廣泛表達Kim-1，缺血性ATN患者尿Kim-1濃度明顯高于其他急、慢性腎臟病患者，說明Kim-1在早期腎損傷診斷中意義的重要性。

一氧化氮（NO）是內源性血管舒張因子，與氧化應激關系密切。研究證實NO在腎缺血再灌注損傷中具有促進細胞凋亡作用[13]。本研究中，在NRK-52E細胞缺血損傷時NO濃度明顯升高，隨再灌注時間延長NO濃度逐漸增加，在再灌注60min時達到峰值，以后逐漸下降，但仍高于缺血前水平。本組對NRK-52E細胞缺血再灌注損傷時細胞凋亡與NO濃度變化進行了相關分析，發(fā)現二者呈直線正相關（r=0.633，P＜0.05）。此外，在細胞凋亡率升高的同時伴隨著Kim-1蛋白的高表達，二者亦呈直線正相關關系（r=0.894，P＜0.01）。這提示AKI與氧化應激有關，當NRK-52E細胞處于缺血缺氧時很容易誘導Kim-1的產生和分泌。

冬蟲夏草（Cordyceps Sinensis） 子在下調TGF-β、CTGF以及C-myc的表達，減輕糖尿病腎病大鼠的蛋白排泄及血肌酐水平，同時下調糖尿病腎病大鼠腎組織ColⅣ的表達，延緩腎小球硬化，并可防治環(huán)孢霉素腎毒性等方面的作用已得到肯定[14-16]。其能否調節(jié)AKI時Kim-1表達和NO水平不甚明了。與文獻報道一致，我們發(fā)現冬蟲夏草具有抗凋亡作用[17]。在本研究中，筆者采用40 mg/L濃度的蟲草提取液對NRK-52E細胞的抗霉素A模型進行干預實驗，發(fā)現冬蟲夏草示出了較明顯的細胞保護效應，表現為缺血再灌注損傷的NRK-52E細胞凋亡率的下降，Kim-1及NO表達的下調，并且以再灌注的30、60和120 min這3個時間點最為顯著。這一結果表明，冬蟲夏草對缺血再灌注損傷的NRK-52E具有良好的抗細胞凋亡作用，可能是通過下調Kim-1、NO的表達，減輕氧化應激而實現的。

總之，急性缺血再灌注損傷是AKI的主要病因，AKI時可啟動細胞凋亡程序并可誘導氧化應激和Kim-1高表達，Kim-1能否成為AKI早期生物學標記物還需在人類的大樣本研究中得到證實，同樣冬蟲夏草對AKI的腎保護作用機制還需進一步深入研究，本研究僅作為初探，為未來的深入研究奠定基礎。

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