凌宏艷，胡 弼，庹勤慧，劉 剛，奉水東，朱炳陽，廖端芳

（1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)藥物藥理研究所 藥理學(xué)教研室，湖南 衡陽 421001；3.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 流行病教研室，湖南 衡陽 421001；4.湖南中醫(yī)藥科大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208）

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是一個全球性的和嚴(yán)重的慢性疾病，遺傳和環(huán)境等因素的改變可導(dǎo)致T2DM的發(fā)生。T2DM發(fā)病機(jī)制的兩個基本環(huán)節(jié)是胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和胰島素分泌不足，其中，IR貫穿了T2DM發(fā)生發(fā)展的全過程[1]。因此，探討IR發(fā)生的分子機(jī)制是控制和改善IR以及預(yù)防和治療糖尿病等代謝綜合征最根本的途徑。微小 RNA（microRNA，miRNAs）是新近證明的一類高度保守的、內(nèi)源性非蛋白編碼的和長度為20～25 nt的小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[1]。近年來研究表明，miRNAs參與調(diào)控細(xì)胞的眾多生物學(xué)過程，如脂肪細(xì)胞分化[2-4]、糖脂代謝[5]、能量的穩(wěn)態(tài)[6]和胰島素的產(chǎn)生和分泌[7-8]等，這些研究提示，miRNAs作為代謝性通路中新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)因子，可能調(diào)節(jié)哺乳動物中與IR相關(guān)的代謝過程。因此，為探討miRNAs在IR中的調(diào)控作用，本研究主要采用miRNAs芯片技術(shù)，分析比較了脂肪細(xì)胞和IR脂肪細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNAs，篩選出與IR相關(guān)的miRNAs，并預(yù)測某些miRNAs可能調(diào)控的靶基因，為闡明IR的致病機(jī)制及其防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清均購于美國Gibco公司；分化誘導(dǎo)劑1-甲基-3-異丁基黃嘌呤（1-methyl-3-isobuthylxanthine，IBMX）、地塞米松（dexamethasone，DEX）、胰島素和2-脫氧葡萄糖均購于美國Sigma公司；3T3-L1前脂肪細(xì)胞株購于美國ATCC公司；Trizol和實(shí)時定量PCR試劑盒購自Invitrogen公司；2-脫氧-[3H]-D葡萄糖購于Amersham公司，余為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要方法

1.2.1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化 3T3-L1細(xì)胞以L-DMEM含10%新生小牛血清在37℃和5%二氧化碳的條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至完全融合后2 d（第0天）時開始誘導(dǎo)分化，將培養(yǎng)液換成含10%胎牛血 清、0.5 mmol/L IBMX、10μg/mL 胰島素和1.0μmol/L Dex的L-DMEM刺激，2 d后換用只含10μg/mL胰島素和10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)2 d，隨后每2天換用含10%胎牛血清的L-DMEM，至第9天用顯微鏡觀察。

1.2.2 實(shí)時熒光定量PCR檢測脂肪酸結(jié)合蛋白（adipocyte fatty acid binding protein 2，aP2）和過氧化物增殖體激活物受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor，PPARγ）的表達(dá) 用Trizol提取總RNA，將1μg的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成第1鏈cDNA，以第1鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)引物如下：aP2：5'-CATGGCCAAGCCCAACAT-3'（正義），5'-CGCCCAGTTTGAAGGAAATC-3（'反義）；PPARγ：5'-CGCTGATGCACTGCCTATGA-3（'正義），5'-AGAGGTCCACAGAGCTGATTCC-3（'反義）；βactin：5'-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3'（正義），5'-AGCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3（'反義）。熒光定量PCR的擴(kuò)增參數(shù)如下：94℃預(yù)變性3 min；95℃變性 30 s、58℃復(fù)性 30 s、72℃延伸 40 s（45 個循環(huán)）；95℃ 1 min；55℃ 1 min；55℃ 10 s（80 個循環(huán)）；降溫至4℃保存，得到熒光定量PCR的擴(kuò)增動力曲線。根據(jù)LIVAK等[9]采用的FQ-RT-PCR的相對定量（2-ΔΔC）t方法，來比較目的基因在不同細(xì)胞中的表達(dá)差異。

1.2.3 3T3-Ll IR脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo) 將6孔培養(yǎng)板中分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞用含5.5 mmol/L葡萄糖的10%胎牛血清培養(yǎng)2 d。為誘導(dǎo)IR，脂肪細(xì)胞分成兩組：正常葡萄糖正常胰島素組（對照組），用含5.5 mmol/L葡萄糖的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；高葡萄糖高胰島素組（IR組），用25 mmol/L葡萄糖和高胰島素液（1μmol/L）處理脂肪細(xì)胞24 h。

1.2.4 葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn) 將6孔板中的脂肪細(xì)胞以含0.2%BSA的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h后，用KRPB緩沖液洗滌3遍，再以含或不含100 nmol/L胰島素的KRPB緩沖液37℃孵育30 min，加入1 mL含 0.5μCi/mL 2-脫氧 -[3H]-D葡萄糖和 0.1 mmol/L 2-脫氧葡萄糖的KRPB緩沖液37℃孵育10 min。以10μmol/L的細(xì)胞松弛素B作為對照，計算細(xì)胞對標(biāo)記葡萄糖的非特異性攝取。細(xì)胞用冰冷的含10 mmol/L葡萄糖的PBS快速洗3次終止反應(yīng)，每孔加入1 mL 0.1 mol/L的NaOH作用20 min，取細(xì)胞消化液，加入到4 mL閃爍液中。在液體閃爍計數(shù)器中檢測樣品的每分鐘衰變數(shù)，各數(shù)據(jù)均減去葡萄糖的非特異性攝取值作為各組細(xì)胞的葡萄糖攝取量，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個復(fù)孔，共重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 miRNA芯片分析 本實(shí)驗(yàn)將Trizol處理的3T3-L1脂肪細(xì)胞和IR脂肪細(xì)胞交至上?？党缮锕具M(jìn)行miRNA芯片雜交?；虮磉_(dá)譜芯片的檢測步驟包括總RNA的提取與鑒定、miRNA標(biāo)記和miRNA芯片雜交等步驟，最后芯片掃描獲得TIFF圖后，使用Genepix Pro6.0軟件分析數(shù)據(jù)，以芯片中的內(nèi)對照熒光值為參照，分別計算實(shí)驗(yàn)組和對照組的標(biāo)準(zhǔn)值；隨后計算IR脂肪細(xì)胞中每一個miRNA的表達(dá)水平和脂肪細(xì)胞同一個miRNA的表達(dá)水平，兩者之比即為改變的倍數(shù)。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 根據(jù)基因芯片的結(jié)果，對顯著變化的2個miRNAs進(jìn)行分析，主要通過3個生物信息學(xué)預(yù)測網(wǎng)站（TargetScan、miRanda和miRBase），取至少2個軟件預(yù)測到的基因作為靶基因。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件包進(jìn)行分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化成成熟脂肪細(xì)胞

誘導(dǎo)分化前的3T3-L1前脂肪細(xì)胞形態(tài)與成纖維細(xì)胞相似，呈典型的梭形，胞漿中未見脂滴，見圖1A；至誘導(dǎo)分化第9天時，90%以上的3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞漿豐富，大量的體積較大的脂滴分布于細(xì)胞核周圍，形成“戒環(huán)樣”結(jié)構(gòu)，即為典型的成熟脂肪細(xì)胞形態(tài)，見圖1B。熒光定量PCR結(jié)果顯示：3T3-L1前脂肪細(xì)胞用分化誘導(dǎo)液處理后，aP2和PPARγ mRNA的表達(dá)水平顯著升高，見圖1C、D。

2.2 IR脂肪細(xì)胞模型的建立

圖2顯示，基礎(chǔ)狀態(tài)下，3T3-L1脂肪細(xì)胞經(jīng)高葡萄糖和高胰島素處理24 h后，葡萄糖攝取率無顯著改變；而在胰島素存在情況下，3T3-L1脂肪細(xì)胞對葡萄糖攝取率明顯增加，約為基礎(chǔ)狀態(tài)下的4.2倍；高葡萄糖和高胰島素使3T3-L1脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取率由（419.0±19.2）%下降到（258.0±17.3）%（P＜0.01），提示高葡萄糖和高胰島素聯(lián)合培養(yǎng)脂肪細(xì)胞可誘導(dǎo)IR脂肪細(xì)胞模型成立。

圖1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化成成熟脂肪細(xì)胞

圖2 高葡萄糖高胰島素對3T3-L1脂肪細(xì)胞3H葡萄糖攝取的影響 （n=3）

2.3 miRNAs基因芯片雜交的結(jié)果

圖3 miRNA表達(dá)譜代表圖

來自3T3-L1脂肪細(xì)胞和IR脂肪細(xì)胞的總RNA經(jīng)純化和Cy3熒光標(biāo)記后，同miRNA芯片進(jìn)行雜交，使用Genepix 4000B在635 nm通道處對雜交后的芯片進(jìn)行圖像掃描，結(jié)果如圖3所示。應(yīng)用Genepix Pro 6.0軟件分析所得數(shù)據(jù)，得到上調(diào)或下調(diào)超過2倍差異表達(dá)的miRNAs共79個：其中，表達(dá)水平降低50%以上者（表達(dá)下調(diào)）共29個，且miR-21下降最明顯；表達(dá)水平升高2倍以上者（表達(dá)上調(diào)）共50個，且miR-320上調(diào)最明顯。

2.4 靶基因的預(yù)測

本實(shí)驗(yàn)選擇IR脂肪細(xì)胞中顯著下調(diào)的miR-21和顯著上調(diào)的miR-320進(jìn)行靶基因預(yù)測。通過3個靶點(diǎn)預(yù)測軟件（TargetScan、miRanda和miRBase）預(yù)測miR-21和miR-320可能的靶基因，為了減少假陽性率，挑選至少出現(xiàn)在2個軟件中的基因作為其可能的靶基因。共篩選出與IR或糖尿病相關(guān)的靶基因13個，其中miR-21有7個；miR-320有6個。見附表。

附表 miR-21和miR-320與胰島素抵抗或糖尿病相關(guān)的靶基因

3 討論

研究表明，miRNAs表達(dá)的異常與IR和糖尿病密切相關(guān)。ESAU等[4]將反義miR-122注入小鼠體內(nèi)導(dǎo)致血漿三酰甘油降低，進(jìn)一步將小鼠的肝細(xì)胞取出培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，肝臟脂肪酸和固醇的合成減少，脂肪酸的氧化增加，表明miR-122調(diào)節(jié)小鼠的脂代謝。XU等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miR-14缺失的果蠅體內(nèi)三酰甘油和二酰甘油的水平提高，然而增加miR-14的表達(dá)則會產(chǎn)生相反的結(jié)果，說明miR-14是脂肪代謝的一個負(fù)性調(diào)控因子。TELEMAN等[7]報道，miR-278缺失的突變型果蠅有胰島素生成增加、體重降低和血糖升高的變化；增加miR-278的表達(dá)可使上述指標(biāo)得以恢復(fù)，這一實(shí)驗(yàn)首次表明改變體內(nèi)miRNAs的表達(dá)對IR具有調(diào)節(jié)作用。WANG等[10]報道，miR-320可促進(jìn)糖尿病大鼠的血管新生；HE等[11]發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠的miR-29高度上調(diào)，將miR-29轉(zhuǎn)染給3T3-L1細(xì)胞，可抑制胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖攝取。這些研究提示，miRNAs作為代謝性通路中新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)因子，可能調(diào)節(jié)與IR相關(guān)的哺乳動物的代謝過程。如果能找到對IR調(diào)控的miRNAs，必將對IR和糖尿病等代謝相關(guān)性疾病的治療提供一個新的基于RNA治療的藥物靶點(diǎn)。

3T3-L1脂肪細(xì)胞是來源于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、經(jīng)克隆擴(kuò)增而成的前脂肪細(xì)胞系，是在體外被廣泛應(yīng)用于脂肪細(xì)胞功能研究和IR發(fā)病機(jī)制研究的重要細(xì)胞模型。本實(shí)驗(yàn)通過經(jīng)典的“雞尾酒”法誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞的形成，隨后用高葡萄糖和高胰島素處理脂肪細(xì)胞24 h，通過葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)高葡萄糖和高胰島素誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞24 h，可明顯抑制脂肪細(xì)胞對培養(yǎng)基中葡萄糖的攝取，提示高葡萄糖和高胰島素可誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞產(chǎn)生IR，從而為下一步的芯片實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

miRNA芯片技術(shù)是一種快速有效地分析miRNA表達(dá)譜的方法，該方法可以更好地了解miRNAs的整體表達(dá)情況。本研究中，以miRNA芯片技術(shù)為平臺，檢測了脂肪細(xì)胞和IR脂肪細(xì)胞的miRNAs表達(dá)譜，篩選得到差異表達(dá)的miRNAs共79個：其中29個表達(dá)下調(diào)，且miR-21明顯下降；50個表達(dá)上調(diào)，且miR-320明顯上調(diào)?？梢?，在IR脂肪細(xì)胞中明顯上調(diào)的miRNAs基因在數(shù)量上超過了在脂肪細(xì)胞中明顯下調(diào)的miRNAs基因。

本研究采用的是丹麥Exiqon公司8.0版的小鼠miRNAs芯片。該芯片上固定的探針包括與人（328個）、小鼠（274個）和大鼠（238個）的miRNAs精確配對的探針、對照探針以及錯配探針，可以檢測Sanger miRBase數(shù)據(jù)庫8.0版中所有已知的人、小鼠、大鼠和其他物種的miRNAs，代表性好；同時能夠高靈敏和高特異性地檢測miRNAs的表達(dá)，準(zhǔn)確檢測樣品中所有miRNAs的表達(dá)水平；且每張芯片對同一樣品重復(fù)4次檢測，進(jìn)一步提高了芯片的可靠性。因此，本研究篩選到的差異表達(dá)的miRNAs將為進(jìn)一步研究miRNAs在IR形成中的調(diào)控作用提供了較多和較可靠的依據(jù)。

目前，在動物體內(nèi)只有小部分miRNAs的生物學(xué)功能得到了闡明，絕大多數(shù)miRNAs的具體功能仍然不清楚，主要是由于在特定的狀態(tài)下尋找miRNAs調(diào)控的靶基因存在一定的困難。生物信息學(xué)預(yù)測靶基因是miRNAs功能研究的重要方法，為此筆者對顯著下調(diào)的miR-21和顯著上調(diào)的miR-320進(jìn)行靶基因預(yù)測，以求進(jìn)一步理解他們與IR或糖尿病的關(guān)系。結(jié)果表明，miR-21的靶基因包括胰島素信號相關(guān)基因PIK3R1和PPP1R3B、脂代謝相關(guān)基因PPARA以及細(xì)胞增殖相關(guān)基因TGFBI、TGFBR2、TIMP3和MAP3K1等；miR-320的靶基因主要為胰島素信號相關(guān)基因 PTEN、PIK3R1、IGF2BP3、IGF1R和IGF1。上述結(jié)果提示這些miRNA的作用靶點(diǎn)廣泛，涉及胰島素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂代謝和細(xì)胞增殖等相關(guān)基因，由此說明：某些關(guān)鍵miRNAs表達(dá)水平的失衡可能是導(dǎo)致IR和糖尿病等代謝性疾病發(fā)生和發(fā)展的重要原因；同時也說明miRNA靶基因預(yù)測為進(jìn)一步研究miRNA在IR和糖尿病發(fā)生中的作用機(jī)制提供了重要線索。

綜上所述，本研究率先以miRNAs芯片技術(shù)對脂肪細(xì)胞和胰島素抵抗脂肪細(xì)胞的miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行研究，經(jīng)過分析比較發(fā)現(xiàn)29個下調(diào)和50個上調(diào)的miRNAs，靶點(diǎn)預(yù)測顯示miR-21和miR-320的靶點(diǎn)非常廣泛，為進(jìn)一步研究它們的功能奠定了基礎(chǔ)。

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