郭 悅，張 楊，孫曉雷，崔 麗，張 瑋，李秀蘭

潰瘍是糖尿病常見和嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，往往反復(fù)發(fā)作，遷延不愈。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察經(jīng)生肌象皮膏與貝復(fù)濟(jì)作用后的糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合規(guī)律和治療效果。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康Wistar大鼠20只，體重200～250 g，雌雄各半，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（SCXK-軍2007-004）。

1.2 主要試劑及藥品 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（Sigma），鏈脲佐霉素（Sigma），艾科靈睿血糖儀及試紙（艾康生物技術(shù)有限公司），貝復(fù)濟(jì)（重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子溶液，珠海億勝生物制藥有限公司），50%乙酸，速眠新Ⅱ注射液（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所），生肌象皮膏（天津醫(yī)院，津藥制字Z20070614號）。

1.3 方法

1.3.1 糖尿病大鼠造模 Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，禁食不禁水18 h，于尾靜脈取血測量初始血糖，以檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制10 mg/mL鏈脲佐霉素（streptozotocin，STZ）溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配），稱體重后按照雄鼠45 mg/kg、雌鼠40 mg/kg進(jìn)行腹腔注射，連續(xù)注射3 d。其間自由飲水及喂食。3 d后經(jīng)血糖儀測定血糖超過16.7 mmol/L，并出現(xiàn)明顯多飲多尿，為糖尿病大鼠造模成功。

1.3.2 潰瘍創(chuàng)面造模 糖尿病大鼠按30 μL/100 g肌注速眠新，麻醉后，于腰背部剪毛備皮。在無菌條件下，于脊柱兩側(cè)各制作直徑為1.4 cm的圓形皮膚缺損，缺損間隔約0.5 cm，去除全層皮膚深至肌層，暴露肌腱。用止血鉗牽拉及50%乙酸點(diǎn)狀涂抹的方式處理創(chuàng)面肌腱，外敷凡士林油紗，連續(xù)3 d，直至肌腱出現(xiàn)潰瘍或壞死。期間每只大鼠單籠飼養(yǎng)，自由飲水與進(jìn)食。

1.3.3 分組換藥 采用完全隨機(jī)分組方法將動(dòng)物分為兩組，每組各10只。生肌象皮膏組于創(chuàng)面外敷生肌象皮膏，棉片覆蓋；貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面在無菌條件下于創(chuàng)面先敷以貝復(fù)濟(jì)50 μL，再外敷凡士林油紗。每天清創(chuàng)換藥，直至最后處死取材。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 血糖 大鼠造模前后血糖值的改變。

1.4.2 創(chuàng)面面積 分別于換藥治療前及治療3、5、7、9、11、13、15、17、19 d，記錄創(chuàng)面變化情況，以硫酸紙描出創(chuàng)面輪廓，用稱重的方法換算出創(chuàng)面面積。

1.4.3 創(chuàng)面愈合率 計(jì)算公式：創(chuàng)面愈合率=（原始創(chuàng)面面積-現(xiàn)創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。

1.4.4 組織學(xué)顯微觀察及超微結(jié)構(gòu)觀察 分別于治療4、7、10、15 d，應(yīng)用角膜鉆于創(chuàng)面取材，10%中性福爾馬林固定，切片，進(jìn)行HE染色，光鏡觀察；6%戊二醛固定后切片進(jìn)行透射電鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式表示，組間差異應(yīng)用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病大鼠模型 經(jīng)鏈脲佐霉素攻擊后的大鼠出現(xiàn)明顯多飲多尿，精神萎靡，3 d后血糖為（20.52±3.43）mmol/L，造模成功率100%。

表1 大鼠糖尿病造模前后體重、血糖值（±s）

表1 大鼠糖尿病造模前后體重、血糖值（±s）

注：與造模前比，*P＜0.05

n造模前造模后20 20體重(g)223.27±17.78 205.48±11.61*血糖值(mmol/L)5.36±0.34 20.52±3.43*

2.2 肌腱損傷潰瘍創(chuàng)面 經(jīng)過化學(xué)及機(jī)械處理后的肌腱均出現(xiàn)明顯潰瘍及壞死，造模成功率100%，見圖1、圖2。

圖1 未經(jīng)處理的創(chuàng)面，肌腱暴露

圖2 造模成功的肌腱壞死潰瘍創(chuàng)面

2.3 創(chuàng)面面積 生肌象皮膏組從換藥第15 d起，各檢測時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面面積均小于貝復(fù)濟(jì)組（P＜0.05），見圖3。

圖3 兩組治療方法不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面面積比較

2.4 創(chuàng)面愈合率 生肌象皮膏組從換藥第15 d起，各檢測時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率始終高于貝復(fù)濟(jì)組（P＜0.05），見圖4。

圖4 兩組治療方法不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率比較

表2 兩組治療方法不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面面積及愈合率比較（n=10，±s）

表2 兩組治療方法不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面面積及愈合率比較（n=10，±s）

注：與貝復(fù)濟(jì)組比較，*P＜0.05

組別治療前治療3 d治療5 d治療7 d治療9 d治療11 d治療13 d治療15 d治療17 d治療19 d生肌象皮膏組創(chuàng)面面積（cm2）2.15±0.31 1.79±0.37 1.51±0.39 1.14±0.38 1.02±0.36 0.86±0.11 0.69±0.15 0.54±0.13*0.44±0.11*0.31±0.11*創(chuàng)面愈合率（%）0 17.37±8.17 30.50±11.40 47.45±13.43 53.06±12.76 59.87±5.60 67.84±7.11 74.89±5.71*79.28±4.80*85.75±5.13*貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面面積（cm2）2.15±0.23 1.93±0.19 1.71±0.24 1.46±0.27 1.24±0.32 1.05±0.27 0.89±0.19 0.79±0.19 0.69±0.21 0.55±0.18創(chuàng)面愈合率（%）0 9.8±7.54 19.85±13.18 35.24±11.75 45.31±13.78 53.51±11.37 60.67±8.42 65.16±8.03 69.42±9.35 75.60±7.93

2.5 組織學(xué)HE染色 糖尿病大鼠伴肌腱損傷潰瘍創(chuàng)面的愈合，符合慢性創(chuàng)面愈合病理過程，包括炎癥反應(yīng)，新生血管和肉芽組織生成，纖維結(jié)締組織成熟和上皮化過程。創(chuàng)面愈合4 d處于炎癥反應(yīng)期，兩組均可見到急性細(xì)胞反應(yīng)和組織壞死及滲出（圖5a）。生肌象皮膏組可見新生的毛細(xì)血管以出芽的方式生成，可見到活躍的成纖維細(xì)胞，為新生的肉芽組織表現(xiàn)，可見大量活躍的巨噬細(xì)胞（圖5b）。貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面組織有少量細(xì)菌團(tuán)，未見肉芽組織新生表現(xiàn)（圖5c）。創(chuàng)面愈合7～10 d，兩組均以肉芽組織生成為主要表現(xiàn)，但程度上生肌象皮膏組較貝復(fù)濟(jì)組明顯，新血管形成，內(nèi)皮細(xì)胞增生活躍，成纖維細(xì)胞大量形成，并有膠原纖維生成（圖5d），可見新生的上皮細(xì)胞（圖5e）。創(chuàng)面愈合15 d，兩組均出現(xiàn)上皮化，鱗狀上皮出現(xiàn)（圖5f），部分區(qū)域可見角化層。潰瘍創(chuàng)面明顯縮小，生肌象皮膏組與貝復(fù)濟(jì)組的縮小程度差異顯著。

圖5 肌腱損傷潰瘍創(chuàng)面愈合不同時(shí)期的組織學(xué)HE染色觀察

2.6 透射電鏡 創(chuàng)面愈合初期兩組均可見炎癥反應(yīng)，生肌象皮膏組可見活躍巨噬細(xì)胞，內(nèi)含有大量的吞噬顆粒、溶酶體，細(xì)胞器發(fā)達(dá)（圖6a），偽足伸出明顯呈活躍狀態(tài)。肉芽組織生成期可見大量的肉芽組織，新生毛細(xì)血管逐漸粗大，由多個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞組成（圖6b），周細(xì)胞緊緊貼附于內(nèi)皮細(xì)胞邊緣?？梢娪字傻某衫w維細(xì)胞呈多角形，胞漿豐富，細(xì)胞器發(fā)達(dá)，細(xì)胞核較大，核仁明顯（圖6c）。成熟的肉芽組織，成纖維細(xì)胞胞漿豐富，線粒體發(fā)達(dá)（圖6d），成纖維細(xì)胞成群排列。

3 討論

STZ對一定種屬動(dòng)物的胰島β細(xì)胞有選擇性破壞作用，能誘發(fā)許多動(dòng)物產(chǎn)生糖尿病，一般采用大鼠和小鼠制造動(dòng)物模型。針對STZ使用劑量、給藥次數(shù)及其對胰島損傷程度方面的研究，各方報(bào)道不盡相同[1-2]。本實(shí)驗(yàn)針對不同性別的大鼠給予不同劑量的STZ，最終麻藥用量都是在經(jīng)過多次預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選定的，符合本實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)條件。

正常創(chuàng)口愈合是個(gè)復(fù)雜而有序的過程，包括止血和炎癥階段、增生階段和塑形階段。多種細(xì)胞、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)之間錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)作用是該過程中的關(guān)鍵因素[3]。創(chuàng)面愈合的基礎(chǔ)是炎癥細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及修復(fù)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞等的一系列生物學(xué)活動(dòng)，其中巨噬細(xì)胞除吞噬消化組織細(xì)胞碎片外，同時(shí)還可分泌多種生長因子，是刺激成纖維細(xì)胞增殖分化，合成膠原蛋白的關(guān)鍵因素。然而在糖尿病潰瘍的早期，創(chuàng)面內(nèi)的炎性細(xì)胞主要是以中性粒細(xì)胞為主，浸潤不明顯，巨噬細(xì)胞數(shù)量少且出現(xiàn)晚，致使創(chuàng)面炎癥期持續(xù)時(shí)間長[4]，創(chuàng)面局部的成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的分裂繁殖速度減慢和細(xì)胞外基質(zhì)合成減少、分解加速，成為創(chuàng)面經(jīng)久不愈的病理基礎(chǔ)。表皮細(xì)胞生長因子、血小板源性生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子等促進(jìn)傷口愈合的細(xì)胞生長因子及E-選擇素，細(xì)胞內(nèi)黏附分子-1，血管細(xì)胞黏附分子-1等黏附分子的合成和分泌減少，包括膠原酶在內(nèi)的各種金屬蛋白酶的合成和分泌增加，是導(dǎo)致慢性難愈性創(chuàng)面病理變化的分子生物學(xué)基礎(chǔ)[5]。

圖6 肌腱損傷潰瘍創(chuàng)面愈合不同時(shí)期的透射電鏡觀察

貝復(fù)濟(jì)主要成分為重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子，對來源于中胚層的細(xì)胞(如真皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等)具有促進(jìn)修復(fù)和再生作用，即可促進(jìn)肉芽組織形成和再上皮化，也就是在創(chuàng)面愈合的增生階段起主要作用。它能促進(jìn)毛細(xì)血管再生,改善局部血液循環(huán),從而加速創(chuàng)面的愈合。但它對于縮短炎癥階段作用并不顯著。

生肌象皮膏主要成分為象皮粉、全當(dāng)歸、生地、生龜板、爐甘石、生石膏、血竭、血余炭、黃蠟、白蠟、麻油，具有抗菌消炎、清熱解毒、鎮(zhèn)痛止血、養(yǎng)血活血、斂瘡收濕、祛腐生肌之功效，既根除外在病灶之標(biāo),又兼顧充實(shí)其本,故收效甚佳。對生肌類外用中藥的研究表明,生肌類中藥影響創(chuàng)面愈合存在很多因素,除創(chuàng)面血運(yùn)、成纖維細(xì)胞及Ⅰ、Ⅲ型膠原、創(chuàng)面免疫力、纖維結(jié)合蛋白、微量元素、pH值、生長因子(表皮生長因子受體、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子)等外,還有細(xì)胞外基質(zhì)、表皮細(xì)胞及多種細(xì)胞因子的作用[6]。李秀蘭等[7]對中醫(yī)外科傳統(tǒng)的療瘡愈傷法則——“偎膿長肉”的作用機(jī)制進(jìn)行了一系列研究，指出生肌象皮膏的抗感染作用不是直接抑菌，而是提高機(jī)體的免疫功能，是良好的免疫促進(jìn)劑。它增加創(chuàng)面毛細(xì)血管通透性，使創(chuàng)面產(chǎn)生大量與西醫(yī)所指的膿有本質(zhì)區(qū)別的有益“膿”，是一種來自于局部微血管的營養(yǎng)液，富含免疫活性細(xì)胞和免疫活性因子，可以有效地調(diào)節(jié)創(chuàng)面組織細(xì)胞的功能，從而抗感染和促進(jìn)組織愈合。這也是生肌膏等外用中藥治愈一般西藥難以治愈的感染創(chuàng)面的根本原因。此外，生肌象皮膏治愈率高，患者痛苦少，不需大量抗生素輔助治療，換藥不需要嚴(yán)格無菌操作等優(yōu)勢，使其應(yīng)用更便利。在本實(shí)驗(yàn)中，通過組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，生肌象皮膏組巨噬細(xì)胞出現(xiàn)早、功能活躍，這說明生肌象皮膏可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的激活，加強(qiáng)巨噬細(xì)胞趨化性，增強(qiáng)其吞噬功能。由此進(jìn)一步促進(jìn)了各種生長因子的分泌，加速肉芽組織形成、上皮化，達(dá)到促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面愈合的目的。

腹腔注射STZ，再選用化學(xué)和機(jī)械損傷方法損傷肌腱是建立糖尿病大鼠肌腱損傷潰瘍創(chuàng)面模型的有效手段，可作為臨床藥物對糖尿病足肌腱損傷潰瘍創(chuàng)面愈合療效評價(jià)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。本?shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，生肌象皮膏組創(chuàng)面縮小程度及創(chuàng)面愈合效果均優(yōu)于貝復(fù)濟(jì)組,其具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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[4]王如然，常柏.生肌象皮膏對糖尿病大鼠難治性潰瘍創(chuàng)面肉芽組織病理結(jié)構(gòu)的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2008,18(17):2451.

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[6]易成剛，郭樹忠，陳建宗.生肌類中藥的理論與實(shí)驗(yàn)研究[J].中國臨床康復(fù)，2004,8(29)：6470.

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