葉菊蓮，占 利，梅玲玲，羅 蕓，姚蘋蘋，姜理平

利用MLST技術(shù)對浙江省大腸桿菌O157的分子流行病學研究＊

葉菊蓮，占 利，梅玲玲，羅 蕓，姚蘋蘋，姜理平

目的 對浙江省2005－2010年大腸桿菌O157分離株進行分子分型研究，了解菌株間的遺傳進化關(guān)系，為浙江省大腸桿菌O157監(jiān)測及爆發(fā)疫情的控制提供基礎。方法 選擇Pasteur大腸桿菌多位點序列分型（Multilocus Sequence Typing，MLST）方案，對大腸桿菌O157分離株及882364菌株進行 MLST分型，確定菌株序列型（Sequence type，ST）；采用DNAsp、eBURST、START2等軟件進行分析。結(jié)果 30株菌中，27株O157∶H7菌株具備相同序列型（ST－284），占90%（27/30），其他3株菌序列型分別為 ST－367、ST－125、ST－296。8個管家基因核苷酸多態(tài)性（Pi）范圍為0.00119（polB）～0.00648（uidA），putP基因多態(tài)性位點比例最高（4.6%），trpA基因多態(tài)性位點比例最低（0.4%）。進化分析結(jié)果顯示，這些序列型分別屬于Group 1及Group 11群。結(jié)論 浙江省動物源性大腸桿菌O157∶H7的主要序列型為ST－284，與江蘇省病人株882364（ST－296）具有同一個進化祖先，提示應加強浙江省大腸桿菌O157病原學監(jiān)測。

大腸桿菌O157；多位點序列分型（MLST）；管家基因；分子流行病學

自大腸埃希菌O157被認識以來，對其基因的研究越來越細，目前已探明了許多結(jié)構(gòu)與功能基因，并發(fā)現(xiàn)存在許多變異株，在其病因?qū)W、病理學及臨床治療方面均有長足的進展。隨著細菌食源性疾病爆發(fā)的日益頻繁以及多重耐藥菌株的不斷涌現(xiàn)，細菌形態(tài)、血清型和噬菌體型等傳統(tǒng)分型方法已不能滿足疫情分析及流行病學研究需要。常用的PFGE一般用于傳染病爆發(fā)調(diào)查，而無法對菌株的遺傳進化特征進行分析；MLST法則適宜于菌株的進化關(guān)系及微生物群體遺傳學分析，一般用于廣義的流行病學研究［1－2］。為了解浙江省分離的大腸埃希菌O157菌株的進化關(guān)系及其群體遺傳學特征，本研究選擇大腸桿菌dinB、icdA、pabB、polB、putP、trpA、trpB、uidA 8個管家基因進行多位點序列分型（MLST），并對分型結(jié)果進行分析，結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株 29株菌均為浙江省疾病預防控制中心2005－2010年從各種動物及病人糞便標本中分離保存的O157菌株，882364為江蘇省分離的O157∶H7菌株。詳細信息見表1。

1.2 主要試劑 API20E生化鑒定條（法國梅里埃公司），大腸埃希菌診斷血清（日本生研株式會社）。PrimeSTARTMHS DNA Polymerase（2.5U/μL）聚合酶、dNTPs、100bp DNA Marker（大連寶生物工程有限公司），瓊脂糖（西班牙Biowest），所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3 儀器 Master cycler gradient PCR擴增儀；FR－200A全自動紫外與可見分析裝置（上海復日科技有限公司）；Minirun GE－100電泳儀（杭州博日科技有限公司），熱裂解儀（杭州博日科技有限公司，HB－100）。

1.4 生化鑒定分型 所有菌株均用API20E生化條進行系統(tǒng)鑒定，符合大腸菌群特性者進行血清分型。

表1 30株大腸桿菌O157菌株信息Table 1 Origins，serotypes and hosts of E.coli O157isolates

1.5 引物合成 參考文獻［3－4］進行引物合成，所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

1.6 模板制備 取平板新鮮分離純菌，懸浮于1mL無菌純水中，置熱裂解儀，100℃，20min，12 000r/min離心5min，取上清液作為DNA模板，－20℃冰箱備用。

1.7 PCR擴增靶基因 50μL反應體系包括0.5 μL PrimeSTARTMHS DNA 酶，上下游引物（10μmol/L）各1μL ，模板5μL。PCR擴增條件參考［3］。取PCR擴增產(chǎn)物3μL以瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.8 DNA測序及MLST數(shù)據(jù)分析 取50μL PCR擴增產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序，測序結(jié)果使用Chromas及DNA Star軟件進行修正后，提交Pasteur在線數(shù)據(jù)庫進行處理，獲得各管家基因的等位基因編碼（allele number），并形成各菌株的序列型。DNAsp5.0分析各管家基因的多態(tài)性，eBURST、START2等軟件分析菌株間的進化關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1生化反應 用法國梅里埃腸桿菌科API 20E生化反應條鑒定，根據(jù)反應編碼查對，所有菌株均為大腸埃希菌，血清分型結(jié)果詳見表1。

2.2 PCR結(jié)果 經(jīng)條件優(yōu)化后，所有受試菌株均擴增出各管家基因并進行測序分析。

2.3 核苷酸多態(tài)性分析 使用DNAsp 5.0軟件分析本研究中30株大腸桿菌8個管家基因的核苷酸多態(tài)性（以Pi表示）。結(jié)果見表2。

表2 30株大腸桿菌O157 8個管家基因核苷酸多態(tài)性分析結(jié)果Table 2 Nucleotide polymorphism found in the eight housekeeping genes used for MLST among 30 E.coli O157 isolates

由此可見，8個管家基因在已收錄的數(shù)據(jù)庫中，trpB存在的多態(tài)性位點比例最高（39.7%），dinB存在的多態(tài)性位點比例最低（26.4%）；而本次所研究的30株EHEC O157中，putP存在的多態(tài)性位點比例最高（4.6%），trpA存在的多態(tài)性位點比例最低（0.4%），這些基因的核苷酸多態(tài)性（Pi）范圍為0.00119（polB）～0.00648（uidA）。

2.4 MLST分型結(jié)果 根據(jù)Chromas圖譜及各等位基因長度，對所得序列進行修正，置于Pasteur MLST數(shù)據(jù)庫中查詢各管家基因的等位基因數(shù)值，進而獲得菌株的ST型。2005－2010年浙江省分離的29株菌株中27株為相同序列型ST－284（59－110－88－63－93－84－83－86），D1、D7及江蘇省的882364的序列型 分 別為 ST－367（8－104－7－3－7－1－2－4）、ST－125（10－2－4－3－18－1－23－4）、ST－296（68－110－91－63－93－84－83－86）；其中ST－284序列型所占比例最多，占90%（27/30）。

2.5 數(shù)據(jù)分析 設定群所需最小相同等位基因數(shù)（Minimum No.of identical loci for group definition）為5，取樣自展值（No.re－samplings for bootstrapping）設置為1000，獲得以下兩組eBURST分析結(jié)果（見圖1、2）?？梢奡T－367和ST－125同屬于Group 1 群，而 ST－284 和 ST－296則屬于 Group 11群。

Jaureguy等研究結(jié)果顯示，ST－192，ST－246，ST－263，ST－264為Pasteur數(shù)據(jù)庫中出血性大腸桿菌的序列型，其中ST246為O26的EHEC的ST型，ST157為一株ETEC的序列型。使用START V2.0軟件，選擇UPGMA對這些進行遺傳進化分析。結(jié)果顯示 ST－284、ST－263、ST－264、ST－296位于進化距離比較近的同一分支上，而ST125和ST367則位于另一距離較近的分支上（見圖3）。

圖3 30株出血性大腸桿菌O157（START V2.0）進化樹Fig.3 MLST dendrogram of E.coli isolates（performed using START V2.0）

3 討 論

近年來，由出血性大腸桿菌（enterohemorrhagic Escherichiacoli，EHEC）引起的食源性疾病在世界范圍內(nèi)許多國家都時有報道，如最近發(fā)生的日本烤肉店生牛肉中毒事件的罪魁禍首就是腸出血性大腸桿菌O111，以及今年5月份發(fā)生在德國由豆苗污染引起的腸出血性大腸桿菌O104∶H4暴發(fā)事件，到目前為止已導致2000多人感染，約數(shù)十人死亡，這次疫情對整個歐洲都造成了一定的影響。EHEC主要包括O157∶H7、O26∶H11和O111∶MN等血清型，O157∶H7是最重要的一種血清型［5－7］。該菌常見于牛、羊等溫血動物的腸內(nèi)。1998年，浙江省開始大腸桿菌O157監(jiān)測，并先后在嘉興、金華、衢州、杭州、舟山、紹興等地市牛、羊、豬等多種動物及腹瀉患者糞便中檢出多株大腸桿菌O157菌株。由于浙江省在地理位置上比鄰江蘇省及安徽省，而江蘇省及安徽省曾經(jīng)出現(xiàn)疫情，為了有效的防止浙江省大腸桿菌O157疫情的發(fā)生，必須及時了解浙江省大腸桿菌O157病原體的分子流行病學狀況，特別是菌株之間的遺傳進化關(guān)系。多位點序列分型可分析不同時間不同地區(qū)臨床分離株的遺傳相關(guān)性，特別適用于多地域相關(guān)性微生物的流行病學、種內(nèi)微進化、來源追蹤和抗生素耐受等的研究。它克服了不同實驗室數(shù)據(jù)重復性及可比性差的缺點，直接利用所測定的管家基因的核苷酸序列組合進行編碼，技術(shù)流程標準化，結(jié)果易于驗證，數(shù)據(jù)便于電腦保存，并可通過互聯(lián)網(wǎng)共享［8，2］。與PFGE相比，更適宜于菌株的進化關(guān)系及微生物群體遺傳學分析，可用于廣義的流行病學研究［1，8］。

目前，適用于大腸桿菌MLST分析的數(shù)據(jù)庫一共有3個［9］，除本研究選用的Pasteur研究中心的數(shù)據(jù)庫外，還有 Whittam數(shù)據(jù)庫（http：//www.shigatox.net/ecmlst/cgi－bin/dbquery）及 Achtman數(shù)據(jù)庫（http：//mlst.ucc.i.e/mlst/dbs/Ecoli）［5］，這3個數(shù)據(jù)庫用來分型的等位基因組合不盡相同。根據(jù)Gordon［10］的研究顯示，這3個數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)存在極高的關(guān)聯(lián)性，說明大腸桿菌的克隆結(jié)構(gòu)是十分健全的，這3個數(shù)據(jù)庫之間的共享及相互之間的聯(lián)系正在研究中。由于Pasteur研究中心的MLST方案依據(jù)的是8個管家基因序列，相比前2個數(shù)據(jù)庫，納入分型范圍內(nèi)的基因種類及長度更多，因此，本研究選擇適用該方案進行浙江省大腸桿菌O157的遺傳性研究。

Clermont等 研 究 顯 示［4，9，11］，不 同 血 清 型 的 大腸桿菌的8個管家基因核苷酸多態(tài)性位點及核苷酸多態(tài)性會存在一定差異，本研究結(jié)果與其相符。核苷酸多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，浙江省所分離的出血性大腸桿菌O157菌株中，管家基因uidA具有最大的核苷酸多態(tài)性（Pi）（0.00648），而putP基因具有最高比例的多態(tài)性位點（4.6%），與Jaureguy等［4］的研究數(shù)據(jù)存在一定差異。這可能與本實驗中的菌株均為出血性大腸桿菌O157以及地區(qū)差異有關(guān)。本研究中27株大腸桿菌O157∶H7具有相同序列型ST－284；菌株編號為D1、D7、882364的是不同的序列型，分 別 為 ST－367、ST－125、ST－296。 根 據(jù)eBURST和START 分析結(jié)果，ST－284、ST－296同屬于Group 11，具有相同的進化祖先，而ST－367、ST－125同屬于Group 1，處于同一進化分支上。這兩個群在等位基因存在較多差異，其進化關(guān)系較遠。從而判斷大腸桿菌O157∶H7與O157：H？處于不同的進化分支上，即不同血清型的菌株起源于不同的祖先，但同一血清型的菌株一般起源于同一個祖先。同時發(fā)現(xiàn)分離自我省動物體內(nèi)的大腸桿菌O157∶H7與江蘇省O157∶H7病人源性菌株具有同一進化祖先，僅dinB、icdA存在差異，而根據(jù)DNAsp分析結(jié)果顯示，這兩個管家基因具有較高的多樣性，因此建議繼續(xù)加強浙江省大腸桿菌O157∶H7的病原學監(jiān)測。而浙江省近年來散發(fā)的O157病人分離菌株屬于同一群，具有相同的進化祖先，這也需要引起重視，注意監(jiān)測大腸桿菌O157的遺傳進化關(guān)系的變換。本研究采用MLST分型技術(shù)，初步分析了浙江省大腸桿菌O157的遺傳進化關(guān)系，但由于標本量少，是否還有其他新的ST型還有待進一步研究。

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Multilocus sequence typing analysis application in molecular epidemiological research ofEscherichiacoliO157isolates in Zhejiang province

YE Ju－lian，ZHAN Li，Mei Ling－ling，LUO Yun，YAO Ping－ping，JIANG Li－Ping

（ZhejiangCenterforDiseaseControlandPrevention，Hangzhou310051，China）

The objective was to investigate the molecular epidemiological feature ofEscherichiacoliO157isolates in Zhejiang Province.A multilocus sequence typing（MLST）scheme was applied to identify sequences of 8housekeeping genes including DNA polymerase（dinB），isocitrate dehydrogenase（icdA），p－aminobenzoate synthase（pabB），polymerase PolII（polB），proline permease，（putP），tryptophan synthase subunit A（trpA），tryptophan synthase subunit B（trpB）and beta－glucuronidase（uidA）from 29EHEC O157isolated between 2005and 2010in Zhejiang Province and 882364isolated in Jiangshu Province.DNAsp，eBURST and START2were applied to analyze the polymorphism of the eight housekeeping genes and the evolution of the EHEC O157.Four sequence types（STs），named ST－284，ST－367，ST－125，and ST－296were identified，which grouped into two lineages，Group 1and Group 11.ST－284had the most proportion of 90%（27/30）.The proportion of variable sites ranged from 0.4%（trpA）to 4.6%（putP）.The nucleotide diversity（Pi，average number of nucleotide differences per site between two randomly－selected isolates）ranged from 0.00119（polB）－0.00648（uidA）.Phylogenetic analysis suggested that these STs belong to two CCs（clone complex）.The data presented here provide new sights into molecular epidemiology feature of EHEC O157.MLST molecular typing of EHEC O157isolates in Zhejiang Province call for intense surveillance efforts.It was an ideal tool to the investigation of the genetic evolution of.EHEC O157.

enterohaemorrhagicEscherichiacoli（EHEC）O157；multilocus sequence typing（MLST）；House－keeping gene；molecular epidemiology

R18

A

1002－2694（2011）10－0901－04

＊國家科技重大專項：艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治（2009ZX10004－210）

占利，Email：lzhan＠cdc.zj.cn

浙江省疾病預防控制中心微生物所，杭州 310051

2011－06－21；

2011－08－10