王憲濤，郭磊，柴宏偉，付玉平，管俊林

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，沈陽 110001）

目前廣泛應(yīng)用的金屬生物材料包括不銹鋼、鈦和基于鈷鉻的合金。這些金屬生物材料在磨損過程中產(chǎn)生的有毒金屬離子和/或者微粒導(dǎo)致的級(jí)聯(lián)炎性反應(yīng)降低了生物相容性。而且，這些金屬生物材料的彈性模量和天然骨組織不相匹配，導(dǎo)致了應(yīng)力遮擋效應(yīng)，這個(gè)應(yīng)力遮擋效應(yīng)導(dǎo)致金屬植入材料對新骨生長和重塑的刺激性減弱，降低了植入物的穩(wěn)定性。在骨折完全愈合后需要二次手術(shù)將其取出，這增加了醫(yī)療費(fèi)用的開支和患者的痛苦。大量實(shí)驗(yàn)研究證明，鎂合金可作為一種可降解體內(nèi)植入材料。Lambotte在1907年首次報(bào)道應(yīng)用純鎂鋼板和鍍金的金屬釘固定小腿下部的骨折。這個(gè)嘗試由于純鎂在體內(nèi)降解過快，術(shù)后8周分解，產(chǎn)生大量皮下氣體而失敗。Troitskii和Tsitrin在1944年報(bào)道了34例用鎂加入少量鎘制作而成的金屬板和金屬釘來固定各種各樣的骨折；34例中9例失敗，這些失敗主要是由于感染；在所治療的患者中，沒有觀察到血清鎂的增高。大部分鎂金屬植入物的機(jī)械完整性能夠維持6～8周，在10～12個(gè)月能夠完全吸收。相反，一些植入物僅僅維持3～5周，這主要是由于骨折部位酸性增加所致。鎂合金在體液環(huán)境中的腐蝕限制了其臨床應(yīng)用。許多實(shí)驗(yàn)研究顯示，隨著合金冶煉技術(shù)和材料表面改性技術(shù)的發(fā)展，鎂合金的體內(nèi)降解速率可以有效控制，而且表面處理可改善鎂合金的表面生物活性。Makard研究發(fā)現(xiàn)鎂合金在氫氟酸溶液中是相當(dāng)穩(wěn)定的，其原因是在氫氟酸溶液中鎂合金材料表面可形成一層穩(wěn)定的氟化鎂（MgF2）［1］。MgF2常被應(yīng)用于工藝方面以提高鎂的耐蝕性［2，3］。但MgF2涂層鎂合金的體內(nèi)生物學(xué)行為及材料本身的降解鮮有報(bào)道。本研究制備MgF2/AZ31B材料并植入大鼠體內(nèi)，評(píng)價(jià)其體內(nèi)生物相容性及材料的降解特性，為鎂合金在醫(yī)用植入材料領(lǐng)域的應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 MgF2/AZ31B鎂合金材料的制備

選用鑄態(tài)AZ31B鎂合金（成分：Al1.2%，Zn0.74%，Mn 0.35%，其余為Mg），將其加工成直徑為2 mm，高度為5 mm的圓柱體，用乙醇和去離子水超聲清洗，然后將其中的一半放入30%的氫氟酸溶液中，在30℃條件下浸泡72 h后將其取出，去離子水沖洗，真空干燥，環(huán)氧乙烷消毒備用。選用相同規(guī)格的鈦合金（Ti-6Al-4V）材料做對照。

1.2 材料體內(nèi)植入試驗(yàn)

取健康成年Wistar大鼠30只（由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量240～300 g。實(shí)驗(yàn)大鼠分組：Ti-6Al-4V對照組10只，AZ31B合金組10只，MgF2/AZ31B合金組10只。無菌條件下在距大鼠股骨髁關(guān)節(jié)面18～20 mm處用2 mm鉆頭作股橫形打孔，將材料植入股骨干內(nèi)。術(shù)后動(dòng)物自由活動(dòng)。于術(shù)后1至26周分別觀察皮膚切口和植入材料周圍組織炎性反應(yīng)，取植入材料周圍骨組織乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣后做蘇木素-伊紅（HE）染色，進(jìn)行常規(guī)病理學(xué)觀察。

1.3 合金的微觀結(jié)構(gòu)分析

將取出的金屬材料浸入2%戊二醛內(nèi)固定8 h后，75%乙醇脫水，真空干燥箱干燥，噴金，采用SSX-550型掃描電鏡（SEM）觀察體內(nèi)植入鎂合金的表面微觀結(jié)構(gòu)，并且進(jìn)行材料表面的能譜分析。再將材料用多聚樹脂包埋后，用2000碳化硅砂紙橫向打磨，在SEM下觀察材料橫截面變化。用圖形處理軟件分析材料降解率（DR）：

2 結(jié)果

2.1 材料周圍組織炎性反應(yīng)評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后活動(dòng)、進(jìn)食正常，切口一期愈合、無感染，動(dòng)物無死亡。術(shù)后1，4，12周，肉眼見各組大鼠材料周圍可見到包裹膜，材料周圍均無急性炎性反應(yīng)，無膿腫形成，無組織壞死。材料周圍骨組織HE染色發(fā)現(xiàn)，植入后1周，MgF2/AZ31B鎂合金組材料周圍未見明顯炎性細(xì)胞浸潤；AZ31B鎂合金材料及Ti-6Al-4V材料周圍則出現(xiàn)炎性細(xì)胞（圖1）。植入后4周，MgF2/AZ31B鎂合金組材料周圍出現(xiàn)大量成骨細(xì)胞及新生骨組織；AZ31B鎂合金材料及Ti-6Al-4V材料周圍則出現(xiàn)大量分層排列有序的成纖維細(xì)胞，Ti-6Al-4V材料周圍仍可見淋巴細(xì)胞浸潤；植入后12周，MgF2/AZ31B鎂合金組材料周圍骨組織與8周時(shí)無明顯差別。

2.2 材料微觀結(jié)構(gòu)分析

SEM觀察發(fā)現(xiàn)，MgF2/AZ31B鎂合金在植入第1周時(shí)表面有許多小孔（圖2a），小孔的底部并未與基體AZ31相通；第4周時(shí)，MgF2/AZ31B鎂合金材料表面出現(xiàn)大量細(xì)胞和有機(jī)蛋白（圖2b）；第12周時(shí)，許多纖維化骨板出現(xiàn)在MgF2/AZ31B鎂合金材料表面（圖2c）；第12周時(shí)，這些骨板已發(fā)生骨化。而AZ31B鎂合金在第1周時(shí)即可發(fā)現(xiàn)材料表面死亡細(xì)胞（圖2d）；第4周時(shí)出現(xiàn)些許紅細(xì)胞及蛋白；第12周時(shí)表面可見薄層蛋白（圖2f）。

2.3 材料表面能譜分析

材料表面能譜發(fā)現(xiàn)（圖3），MgF2/AZ31B鎂合金材料和AZ31B鎂合金材料表面出現(xiàn)鈣與磷，且其含量在8周之內(nèi)逐漸增高。但是，對比這2組我們可以發(fā)現(xiàn)，MgF2/AZ31B鎂合金材料組鈣與磷的含量增高更快。其中，第4周與第8周的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 材料降解分析

材料橫斷面電鏡掃描觀察顯示，MgF2/AZ31B鎂合金在動(dòng)物體內(nèi)降解更為均勻、緩慢，第26周時(shí)降解率約為20.68%，而AZ31B鎂合金降解率約為33.7%。材料植入第26周時(shí)，Ti-6Al-4V沒有降解（圖4）。因此，MgF2能夠延緩AZ31B鎂合金在體內(nèi)的降解。

3 討論

氟對健康有積極作用。自然界中的植物普遍含有氟，正常成人體內(nèi)含氟量約為2.6 g，占體內(nèi)微量元素的第3位，主要分布于骨骼、指甲及頭發(fā)中。WHO等世界性組織根據(jù)氟化物預(yù)防齲齒作用，將氟列為可能的必須微量元素，參與骨骼的代謝。流行病學(xué)觀察指出，低氟區(qū)居民的骨密度降低及骨質(zhì)疏松者明顯地比高氟區(qū)多，臨床應(yīng)用氟化物治療骨軟化和骨質(zhì)疏松有較好效果。

良好的生物相容性是材料植入體內(nèi)的前提。而評(píng)價(jià)生物材料生物相容性較可靠的方法是動(dòng)物體內(nèi)植入試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)采用AZ31B及目前廣泛應(yīng)用于臨床的Ti-6Al-4V鈦合金作對照材料。植入1周時(shí)MgF2/AZ31B鎂合金材料周圍未見明顯炎性細(xì)胞浸潤；植入4周時(shí)，MgF2/AZ31B鎂合金材料周圍無明顯包膜形成。因此，MgF2/AZ31B鎂合金材料生物相容性良好，適合進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。

早期良好的成骨作用是骨組織內(nèi)植材料的重要特性。骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞的募集是骨誘導(dǎo)的中心環(huán)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后第1周，我們發(fā)現(xiàn)大量骨髓基質(zhì)細(xì)胞（圖1）；在第4周，他們分化成為成骨細(xì)胞，此時(shí)還可發(fā)現(xiàn)新生骨組織。Cooper等［4］研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)氟處理過的鈦合金表面能夠刺激間充質(zhì)細(xì)胞和前成骨細(xì)胞增殖與分化，這可能與含氟復(fù)合物中釋放的氟的作用有關(guān)［5］。Bellows等［6］證明氟能夠引起成骨細(xì)胞的增殖、分化，并且伴有堿性磷酸酶和膠原的表達(dá)增加。體外研究發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞與氟處理過的材料聯(lián)合培養(yǎng)，細(xì)胞增殖率更高［7］。經(jīng)氟處理過的材料表面細(xì)胞增殖率更高，骨唾液酸糖蛋白和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的表達(dá)更高［8］。

骨組織的形成與植入材料表面形態(tài)密切相關(guān)。Davies等［9］認(rèn)為植入材料表面形態(tài)對早期骨的形成、血塊的形成及滯留有積極的作用。經(jīng)過氟處理的TiO2，其植入體內(nèi)后新生骨-材料接觸面積較沒有處理的TiO2明顯增高［10］。在我們的研究中，MgF2涂層擁有粗糙的表面形態(tài)。在植入后第4周，MgF2/AZ31B材料表面就完全被大量細(xì)胞和有機(jī)蛋白覆蓋。在術(shù)后第4周與第8周時(shí)，MgF2/AZ31B鎂合金材料表面鈣磷含量較AZ31B鎂合金組顯著增高。這說明AZ31B鎂合金經(jīng)過氫氟酸處理后，有利于材料周圍骨生成。成骨細(xì)胞活動(dòng)增加的可能機(jī)制包括氟對氟敏感堿性磷酸酶的誘導(dǎo)［11］，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放［8］，生長因子信號(hào)途徑中蛋白的相互作用。MgF2/AZ31B鎂合金能夠誘導(dǎo)早期骨生成增加的具體原因目尚不清楚。氟離子對成骨細(xì)胞的直接作用，氟離子對蛋白吸附和細(xì)胞吸附的間接作用，以及材料表面氟的間接作用均可能與鈣磷的沉積有關(guān)［8］。

植入材料降解的可控性是可降解材料安全應(yīng)用于臨床的重要保證。在植入早期，MgF2涂層可有效的隔離基體AZ31B鎂合金，使其與體液分開，免受腐蝕。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MgF2涂層能夠早期降低鎂合金LAE442的降解速率，在第12周時(shí)，無涂層LAE442降解率為10%，而氟化鎂涂層LAE442降解率為4%［12］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MgF2涂層更有效地控制了AZ31B的降解；在植入后第26周，AZ31B的降解速率約為33.70%，而MgF2/AZ31B降解速率約為20.68%。我們認(rèn)為，MgF2涂層控制AZ31B降解的可能與其良好的成骨作用有關(guān)：氟化鎂陶瓷AZ31B鎂合金材料周圍骨組織形成較早，而骨組織的含水量較其他組織更低，進(jìn)而延遲了AZ31B的降解。

MgF2/AZ31B鎂合金植入動(dòng)物體內(nèi)早期未引起材料周圍組織炎性反應(yīng)，植入早期材料周圍大量的成骨細(xì)胞黏附，材料表面鈣磷含量明顯增高，證實(shí)MgF2/AZ31B鎂合金具有早期成骨作用。植入后第26周，MgF2/AZ31B鎂合金降解率約為20.68%，較AZ31B鎂合金組（33.70%）顯著降低，MgF2可有效調(diào)控AZ31B鎂合金基體在動(dòng)物體內(nèi)的降解速率。

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