張永莉，李社莉，李寶莉，王炎林，施秉銀，呂雙燕，李亞

（1.延安大學附屬醫(yī)院內分泌科，陜西 延安 716000；2.延安大學醫(yī)學院，陜西 延安 716000；3.西安交通大學第一附屬醫(yī)院內分泌科，西安 710061）

近年來，隨著分子生物學的飛速發(fā)展，以及原位雜交免疫組化等先進技術的廣泛應用，人們在頜下腺中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)或分離提取出30多種生物活性物質，它們或直接分泌入血，或隨唾液進入消化道再由胃腸吸收入血，對多種組織和細胞的生理活動起調節(jié)作用。其中有些因子完全達到激素的標準，故有人提出頜下腺具有內分泌和外分泌雙重功能。我們先前曾用免疫組化的方法觀察到大鼠頜下腺內含有降鈣素（calcitomin，CT）免疫反應陽性細胞［1］，這就意味著頜下腺能分泌降鈣素，為了證實這一結果，我們設計了本實驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：8 d生SD雄性大鼠，由西安交通大學醫(yī)學院動物實驗中心提供。

1.1.2 試劑：DMEM/F12培養(yǎng)液，由賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司生產；胎牛血清，由蘭州榮曄生物科技有限責任公司生產；兔抗角蛋白單克隆抗體（CK-8），北京博奧森生物技術有限公司產品；兔抗CT抗血清 由美國NeoMarkers公司生產；SP免疫組化染色試劑盒及DAB顯色劑，由北京中杉金橋生物技術有限公司提供；敏感性加強型原位雜交檢測試劑盒Ⅰ型為武漢BOSTER公司產品；地高辛標記的CT DNA寡核苷酸探針由北京奧科生物技術有限責任公司合成。

1.2 方法

1.2.1 大鼠頜下腺細胞培養(yǎng)方法：在無菌條件下，大鼠斷頸處死后獲得頜下腺，剪碎、消化、離心，用差速黏貼法清除纖維細胞，接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，2～3 d后首次換液，8～9 d后進行傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下進行觀察。

1.2.2 免疫細胞化學SP法鑒定細胞來源及進行降鈣素的細胞定位：取培養(yǎng)第5天的細胞爬片，4%甲醛固定，采用免疫細胞化學SP法，按試劑盒說明操作，兔抗鼠CK8抗體及降鈣素一抗的濃度分別為1∶400和1∶25。陰性對照：用PBS代替一抗，相同條件，同批次染色，鏡下觀察。

1.2.3 CT原位雜交：用多聚賴氨酸處理過的蓋玻片進行細胞爬片，細胞長滿95%～100%時取出，按試劑盒說明操作，陰性對照：用不含探針的雜交緩沖液代替含探針的雜交液，鏡下觀察。

1.2.4 CT探針的引物設計與合成：根據(jù)GenBank上登錄的哺乳動物的氨基酸保守區(qū)來設計，由北京奧科生物技術有限責任公司合成，為5，DIG修飾，堿基數(shù)31 個，分別是：5′-CCCATAATAGCCCAGAG AACAGCCAGAGAGG-3′，引物的 Tm 值 70.8，包含的堿基個數(shù)：A12 G8 C9 T2，分子量9542。

2 結果

2.1 頜下腺細胞的形態(tài)

倒置顯微鏡下見體外培養(yǎng)的原代腺細胞第3天開始細胞貼壁、伸展變形，有的形成克隆，增殖的細胞呈形態(tài)一致的立方形，多邊形和圓形，8～9 d后見細胞長滿培養(yǎng)瓶的80%，呈集落生長，鵝卵石樣排列（圖1），可傳代培養(yǎng)。傳代細胞形態(tài)與原代相似。

2.2 CK8及CT免疫細胞化學結果

細胞爬片進行所培養(yǎng)細胞的來源鑒定，分別用兔抗角蛋白單克隆抗體（CK-8）及兔抗鼠CT作為一抗，用SP免疫組化染色試劑盒進行染色，DAB顯色。CK8免疫細胞化學結果顯示：免疫反應陽性細胞，胞質呈黃色或棕黃色，胞核呈藍色，背景不著色，陽性細胞很易鑒別。陰性對照片，細胞質不著色，呈陰性反應（圖2，4）。頜下腺細胞CT免疫細胞化學結果：免疫細胞化學陽性細胞胞膜和胞質呈黃色，著色好，胞核呈藍色（圖3），陰性對照不著色（圖4）。

2.3 CT原位雜交結果

雜交信號陽性細胞胞質呈藍紫色，細胞核呈紅色，背景不著色，陽性細胞很易辨認。在所培養(yǎng)的大鼠頜下腺細胞CTmRNA雜交信號分布很廣泛，而且一致，信號物質位于頜下腺腺泡細胞的細胞膜及胞質內，胞核呈陰性，陰性對照片細胞質未染色，呈陰性反應，胞核呈紅色。（圖5，6）

3 討論

CT分布于甲狀腺C細胞，它是調節(jié)體內鈣磷代謝的重要激素之一。頜下腺屬于消化腺，其可產生消化酶參與食物的初步消化。近年來人們發(fā)現(xiàn)頜下腺又可產生多種生物活性物質，參與機體多種生理功能的調節(jié)［2］，在大鼠頜下腺中的顆粒曲管細胞能合成、儲存、釋放近30種生物活性多肽，如上皮生長因子、血管舒緩劑、胰島素、內皮素、肝細胞生長因子等［3］。陸續(xù)還有新的生物活性物質在大鼠頜下腺被發(fā)現(xiàn)。如：付建芳等［4］發(fā)現(xiàn)頜下腺有卵泡刺激素及黃體生成素的表達，陳蕾等［5］觀察到大鼠頜下腺有黃體生成素及其受體的表達等。還有報道［6］促性腺激素釋放激素及其受體可共存于頜下腺等組織中。我們先前曾用免疫組化的方法觀察到大鼠頜下腺漿液性腺泡細胞及混合性腺泡的漿液細胞內含有CT免疫反應陽性物質，推測大鼠頜下腺可以合成和釋放CT。為進一步證實上述推論，我們設計了本實驗。通過體外培養(yǎng)大鼠頜下腺細胞，并用CK8抗體鑒定其確系上皮細胞來源，但是所培養(yǎng)的上皮細胞是否為漿液性細胞，不好確定；再用兔抗鼠CT一抗進行所培養(yǎng)大鼠頜下腺細胞的免疫細胞化學染色，結果顯示頜下腺細胞呈CT免疫反應陽性，細胞質呈黃色或棕黃色，細胞核呈藍色，確定其細胞質含有CT，與我們先前免疫組化結果一致［1］；用地高辛標記的CT寡核苷酸探針進行原位雜交，觀察到：大鼠頜下腺細胞呈CT雜交信號陽性反應，細胞質呈藍紫色，胞核呈紅色，背景不著色。以往報道頜下腺分泌生物活性物質多采用免疫組化的方法，易出現(xiàn)假陽性結果。本實驗是先前免疫組化研究的深化，首次從細胞水平及基因水平證實了頜下腺能合成和分泌CT，但通過何種細胞轉導通路尚不得而知，有待進一步研究。我們推測：甲狀腺與頜下腺以及胃腸胰同是由內胚層分化形成的，它們在結構和功能方面密切相關。因此，頜下腺上皮細胞與甲狀腺C細胞可能為同源細胞，頜下腺也參與體內鈣磷代謝的調節(jié)。

［1］戴光榮，張永莉，施秉銀.大鼠頜下腺降鈣素的免疫組織化學定位［J］.解剖學報，2006，37（1）：99-101.

［2］Mizrachi D，Shemesh M.Follicle-stimulating hormone receptor and its messenger ribonucleic acid are present in the bovine cervix and can regulate cervical prostanoid synthesis［J］.Biol Reprod，1999，61（3）：776-784.

［3］Gresik EW，Hosoi K，Kurihara K，et al.The rodent granular convoluted tubule cell-an update［J］.Eur J Morphol，1996，34（3）：221-224.

［4］付建芳，黃威權，王世鄂，等.大鼠下頜下腺卵泡刺激素、黃體生成素的分布及與促性腺激素釋放激素受體的共定位研究［J］.解剖學報，2004，35（6）：652-655.

［5］陳蕾，白宏偉，孫緒德.大鼠頜下腺黃體生成素及其受體的定位、核心片段的克隆及序列分析［J］.解剖學報，2007，38（5）：572-576.

［6］于輝，唐旭，呂葆真，等.卵泡刺激素受體在大鼠下頜下腺及胃的定位和分布研究［J］.解剖學報，2006，37（3）：337-339.