趙大力,韓中波,周亞麗

(1.長春國際旅行衛(wèi)生保健中心,吉林長春 130062;2.吉林市結核病防治研究所,吉林吉林 132011）

結核病是嚴重危及全球的公共衛(wèi)生問題之一,高耐藥性結核病的流行,成為結核病診斷和治療的難點。結核菌的培養(yǎng)和藥敏結果,在結核病的防治中起著重要作用[1]。目前公認的結核分枝桿菌培養(yǎng)方法有兩種,一是液體培養(yǎng)基快速檢測法,其營養(yǎng)成分高,培養(yǎng)速度快,一般僅需10-20天,藥敏僅需10天。缺點是價格昂貴,不能客觀觀察結果,需特殊儀器(設備與培養(yǎng)基均需進口）,其次是藥敏試驗種類少。二是改良羅氏培養(yǎng)法,是我國普及通用的結核分枝桿菌培養(yǎng)方法,為固相培養(yǎng)方法,是利用自制培養(yǎng)基在直視觀察下,結核桿菌的菌落生長情況。其優(yōu)點是藥敏試驗種類廣泛,可以選擇出敏感藥物,以指導臨床化療方案的制定、價格低廉,但缺點是時間長,培養(yǎng)需6-8周,藥敏時間一般又需4周。我們針對性地開展二者優(yōu)勢互補作用的探討,研究結核分枝桿菌固液雙向培養(yǎng)基。

1 材料和方法

1.1 7H9液相培養(yǎng)基的制備7H9干粉培養(yǎng)基購自美國sigma公司 ,取干粉2.35 g,蒸餾水溶解后加入2 ml甘油,蒸餾水補足至450 ml,高壓滅菌、待冷卻后 ,按 50 μ g/ml加入羥芐青霉素 、10 μ g/ml加入兩性霉素B,營養(yǎng)增強劑(OADC）50 ml混勻,置 4℃冰箱備用。

1.2 液體PNB培養(yǎng)基配制取0.5 gPNB加無菌蒸餾水10 ml溶解后,加90 ml 7H9液體培養(yǎng)基內,分裝中號試管,置4℃冰箱備用。

1.3 固液雙相培養(yǎng)基的配制接種菌株前制備,以改良羅氏培養(yǎng)基為基礎,加入7H9液相培養(yǎng)基4 ml(約占斜面的一半）。

1.4 標準菌株及菌懸液的制備用接種環(huán)挑取菌落若干,于含有2滴 0.5%Tween80生理鹽水試管內,用圓頭玻棒,在試管底部研磨成糊狀,用生理鹽水將菌液稀釋成1 mg/ml菌懸液,再用生理鹽水作梯度稀釋,H37Rv制成為10-1-10-8mg/ml各種不同濃度菌懸液。其他分枝桿菌制成10-3mg/ml菌懸液備用。

1.5 基礎試驗將雙相培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶打開,取上述菌懸液0.2 ml,分別接種在兩種不同(改良羅氏和固液雙相）的培養(yǎng)基上,各接種2組。置37℃溫箱內培養(yǎng),1周內每天觀察一次結果,記錄結核桿菌在兩種培養(yǎng)基上的生長情況。

1.6 臨床標本試驗取本院結核科患者晨痰1份.于無菌試管內,加2%氫氧化鈉2-4倍,用吸管充分混勻后置37%溫箱30 min(其間混勻2次）使之完全液化。取液化后試管內中層痰液0.2 ml,分別接種于固液雙相培養(yǎng)基、羅氏培養(yǎng)基和PNB培養(yǎng)基,每份2瓶,置37℃溫箱培養(yǎng),每周記錄陽性數(shù)和污染數(shù)至8周為止,并記錄每份標本的初期生長時間。PNB培養(yǎng)基不生長者為人型或牛型結核桿菌。

1.7 藥物敏感性實驗改良羅氏培養(yǎng)基藥敏實驗按常規(guī)絕對濃度法操作,藥物濃度分別為INH(1、10 μ g/ml）、SM(10 、100 μ g/ml）、RFP(50 、250 μ g/ml）、EMB(5、50 μ g/ml）,固液雙相培養(yǎng)基藥敏實驗 ,將藥物加到液體培養(yǎng)基中,藥物終濃度為INH(0.2 μ g/ml）、SM(2 μ g/ml）、RFP(1 μ g/ml）、EMB(4 μ g/ml）。并記錄每份標本的初期生長時間,對各種藥物的耐藥情況。

2 結果

2.1 結核桿菌在固液雙相培養(yǎng)基上生長的情況H37Rv 10-1mg/ml菌液在接種后第3天液相培養(yǎng)基中段略變混濁,有5-8個白色顆粒狀菌落出現(xiàn)。第5天即有15-20個菌落,8天時中段呈乳白狀混濁,轉動試管可見無數(shù)菌落。固相在第6天出現(xiàn)明顯小菌落,第9天布滿斜面。菌落略粗糙,與改良羅氏培養(yǎng)基上菌落相同。將液相和固相菌落挑出分別涂片抗酸染色,均呈典型抗酸桿菌,但前者有索狀形成,后者菌體稍短。

2.2 臨床標本分離培養(yǎng)結果見表1。

表1 臨床標本分離培養(yǎng)結果

經(jīng)統(tǒng)計學分析兩種培養(yǎng)基的污染率無顯著性差異(P＞0.05）

2.3 固液雙相培養(yǎng)基和改良羅氏培養(yǎng)基生長速度的比較,結果見表2。固液雙相培養(yǎng)基的固相培養(yǎng)基結核菌生長稍晚于液相培養(yǎng)基,但優(yōu)于羅氏培養(yǎng)基。

表2 固液雙相培養(yǎng)基和改良羅氏培養(yǎng)基生長速度的比較

結核分枝桿菌在固液雙相培養(yǎng)基平均生長時間14.4天,改良羅氏培養(yǎng)23.5天,前者平均生長快9.1天,二者有顯著性差異(P＜0.01）。

2.4 結核分枝桿菌在兩種培養(yǎng)基上的藥敏情況對比分析見表3。應用固液雙相培養(yǎng)基進行藥敏實驗,報告的平均天數(shù)為11.7天,改良羅氏培養(yǎng)基進行藥敏平均為20.5天,提前了8.8天。

表3 兩種方法測定103例結核分枝桿菌藥敏結果對比分析

兩種培養(yǎng)基上的藥敏情況,經(jīng)統(tǒng)計學分析各種藥物均無顯著性差異(p＞0.05）。

2.5 幾種培養(yǎng)基價格的對比分析(藥敏按四種藥物計算）見表4。

表4 幾種培養(yǎng)基價格的對比

由表4可看出:應用固液雙相培養(yǎng)基進行結核菌培養(yǎng)、藥敏所需的成本與改良羅氏培養(yǎng)基相當,確遠遠低于液體培養(yǎng)基的價格。

3 討論

結核桿菌在雞蛋或含血清瓊脂等固體培養(yǎng)基上生長緩慢的關鍵、是標本經(jīng)酸或堿處理直接接種在培養(yǎng)基上后,至少需2-3天培養(yǎng)基才能緩沖堿,達到pH7.2左右。此外細菌細胞不能有效地吸收營養(yǎng)成分而導致細菌對數(shù)生長期延滯,而本研究設計固液雙相培養(yǎng)基pH為6.5-6.7接種氫氧化鈉與痰的混合液后,使pH改變至7.0-7.2。尤其是細菌細胞在液相培養(yǎng)基內可使細菌浸泡在營養(yǎng)成分中以利于新陳代謝對數(shù)生長期提前。本研究基礎實驗證明,說明固液雙相培養(yǎng)基的優(yōu)越性。液體培養(yǎng)基陽性菌落呈白色顆粒狀,難以鑒別菌落特性,而固相生長的菌落則典型,易于判斷,且有利于藥敏試驗菌落的挑選。雙相培養(yǎng)基液相部分可達到快速培養(yǎng)的目的,固相可提供分枝桿菌典型菌落,體現(xiàn)了雙相培養(yǎng)基的優(yōu)點[2]。從臨床陽性標本結果顯示雙相培養(yǎng)基平均生長時間比羅氏培養(yǎng)基快8.1天左右,尤其是雙相培養(yǎng)基生長結束時間在30天.而傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)基規(guī)定為8周,所以使用雙相培養(yǎng)基可使結核培養(yǎng)縮短1個月。

本研究雙相培養(yǎng)基用磷酸鹽調節(jié)pH6.5-6.7,痰標本經(jīng)2%氫氧化鈉處理后不中和、不離心直接接種,操作十分簡便,且固相培養(yǎng)基上生長的菌落典型,易于挑取,有利于藥敏實驗菌懸液的定量制作。其污染率與改良羅氏培養(yǎng)基的污染率無無顯著性差異,在改良羅氏培養(yǎng)基中,微量孔雀綠既可抑制雜菌的生長,又可對結核桿菌的生長有促進作用。在Middle brook 7H9的基礎上,羧芐青霉素C、兩性霉素B即可制備成結核菌素的選擇培養(yǎng)基,其目的主要是為了減少污染率,提高陽性率。

菌型鑒定采用PNB固液雙相培養(yǎng)基,在10天內可達到初步篩選結核分枝桿菌的目的。

在藥敏方面,傳統(tǒng)的含藥羅氏培養(yǎng)基上存在抗結核藥物受熱失活和蛋白質吸附兩個主要問題至今尚未解決,而固液雙相培養(yǎng)基的優(yōu)點在于不存在高蛋白組分對藥物的吸附作用,又無加熱凝固等造成藥物失活問題,因此在藥敏試驗方面有著顯著的優(yōu)越性。本實驗表明固液雙相培養(yǎng)基的藥敏結果與改良羅氏培養(yǎng)基無顯著性差異。藥敏試驗報告結果比羅氏培養(yǎng)基平均早8.8天,多數(shù)藥敏結果可在2周內報告,對結核病的臨床治療有重要指導意義。

本研究結果證明固液雙相培養(yǎng)基有刺激結核桿菌生長的作用,尤其是其價格低廉,制作方便,操作簡單,適合于我國廣大基層醫(yī)院和結核病院應用,并有很高的應用價值。

[1]申建維,袁 瑋,李 娉,等.平菇雙相培養(yǎng)基用于結核桿菌培養(yǎng)的研究[J].中國防癆雜志,2001,23(4）:241.

[2]匡鐵吉,董 梅,張青霞,等.匡氏瓊脂培養(yǎng)基用于痰結核菌直接藥敏試驗的效果研究[J].中國檢驗醫(yī)學與臨床,2002,3(2）:54.