張家留,張 豐*,殷麗萍,于如同

(1.江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,江蘇南京 210028;2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院）

膠質(zhì)瘤是主要的顱內(nèi)腫瘤之一,其預(yù)后不佳。探討膠質(zhì)瘤發(fā)生過程中增殖、侵襲的的分子病因?qū)W機(jī)制,以尋找相應(yīng)的治療靶點(diǎn)是臨床和科研工作中的迫切需求[1]。黏著斑激酶(FAK）的激活,是腫瘤發(fā)生侵襲的重要機(jī)制,FAK通過增強(qiáng)整合素和生長因子介導(dǎo)的Ras-MAPK的通路活性,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。酪氨酸激酶Src是腫瘤早期出現(xiàn)的致癌性蛋白激酶,參與諸如細(xì)胞周期、增殖、細(xì)胞骨架形成、生長因子信號(hào)傳遞等諸多腫瘤生長相關(guān)機(jī)制[2,3]。Src與FAK關(guān)系密切,Src結(jié)合并激活FAK,而活化的FAK-Src復(fù)合物則通過底物磷酸化介導(dǎo)下游反應(yīng)。抑癌基因PTEN能通過抑制黏著斑激酶(FAK）和酪氨酸激酶 Src的磷酸化,從而選擇性Ras-MAPK通路[4,5]。但PTEN的泛素連接酶NEDD4-1(neural precursor cell expressed developmentally downregulated 4-1）的過表達(dá)能夠下調(diào)PTEN的功能,從而促使腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移[6]。

對(duì)于Src蛋白在NEDD4-1介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤在侵襲性的作用,目前尚無臨床報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬采用RNA干擾技術(shù)(RNAi）,通過抑制Src在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系中的表達(dá),探索其對(duì)下游信號(hào)分子蛋白的影響,進(jìn)一步揭示Src在干擾膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)依托徐州醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科及神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(該實(shí)驗(yàn)室為SPF級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）。實(shí)驗(yàn)中的硬件及軟件材料大部分由該實(shí)驗(yàn)室提供,其中實(shí)驗(yàn)中所需的U251細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心）。所需的pcDNA3.1-NEDD4-1質(zhì)粒由美國Memorial Sloan-Kettering腫瘤中心細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。pGPU6/GFP/Neo-NEDD4-1質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存。pcDNA3.1-Src siNRA質(zhì)粒均根據(jù)所查相關(guān)堿基序列購于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)中所需的抗體:FAK(C-20）(Santa Cruz公司,Sc-558）;FAK(phosphoY397）(Genetex公司,Gtx24803）;山羊抗兔IgG抗體的二抗;小鼠抗人GAPDH單克隆抗體(上海吉?jiǎng)P化學(xué)技術(shù)公司）

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)分4組:(A）pcDNA3.1-空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(B）pcDNA3.1-NEDD4-1組:U251轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NEDD4-1,(C）pcDNA3.1-NEDD4-1+Src轉(zhuǎn)染細(xì)胞組:U251轉(zhuǎn)染NEDD4-1及Src,(D）Src siRNA組:U251轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Src siRNA。最后通過Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)及劃痕法遷移實(shí)驗(yàn)觀察膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞侵襲情況。

1.2.2 ShRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建通過查詢Src基因序列,利用Elbashir[7]等推薦的siRNA設(shè)計(jì)原則,尋找合適的siRNA靶序列。采用NCBIGenBank(美國國立醫(yī)學(xué)圖書館和美國國立衛(wèi)生研究院編寫）提供的BLAST軟件對(duì)選擇的靶序列進(jìn)行同源分析,排除siRNA非特異性地抑制其他基因片段的可能。采用Ambion公司的shRNA在線設(shè)計(jì)軟件(www.ambion.com）設(shè)計(jì)可克隆入 pGPU6/GFP/Neo表達(dá)載體的shRNA,Src siRN的有效作用靶點(diǎn):5′-AAGCTGTTCGGAGGCTTCAAC-3′(226-244 bp）購于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2.3 試驗(yàn)中通過對(duì)該序列質(zhì)粒DNA小量快速抽提后,并大量制備和純化。然后質(zhì)粒的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后移除轉(zhuǎn)染試劑,轉(zhuǎn)染72 h后換完全培養(yǎng)基(1640,加10%的FBS,青霉素、鏈霉素各100 μ g/ml）,分別于轉(zhuǎn)染后1,3,5,7 d收集細(xì)胞檢驗(yàn)?zāi)康幕虻幕钚浴Ｗ詈笸ㄟ^Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(參照Valster A,et al(2005）.Cell migration and invasion assays.Methods37(2）208-215報(bào)道方法進(jìn)行操作。在24孔板中放入轉(zhuǎn)移培養(yǎng)皿(Transwell,培養(yǎng)皿直徑6.5 mm,微孔徑 8.0 μ m）,轉(zhuǎn)移培養(yǎng)下室加600 μ l含0.5%的胎牛血清(作為趨化因子）的DMEM。細(xì)胞用2 mmol/L EDTA消化、離心,收集并用無血清DMEM洗滌兩次,重懸于無血清DMEM中,調(diào)節(jié)濃度至 2×105細(xì)胞/ml,取100 μ l細(xì)胞懸液加入上室,0.5%結(jié)晶紫染色5 min,在200倍顯微鏡下計(jì)數(shù)膜下細(xì)胞以膜下細(xì)胞的數(shù)量多少表示遷移能力。每組細(xì)胞進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。）及劃痕法遷移實(shí)驗(yàn)(參照Valster A,et al(2005）.Cell migration and invasion assays.Methods37(2）,208-215報(bào)道方法進(jìn)行操作。取80%匯合的細(xì)胞,胰蛋白酶消化后以1.2×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于包被有Fn的6孔培養(yǎng)板上,貼壁12 h后換無血清培液培養(yǎng)24 h,細(xì)胞基本匯合。用無菌1 ml槍頭垂直在培養(yǎng)板底劃平行、垂直的4對(duì)‖劃痕,無血清培液沖洗若干次,以洗去被劃下的細(xì)胞。于指定時(shí)間點(diǎn)在顯微鏡下從劃痕邊緣遷移出的細(xì)胞,每組設(shè)雙復(fù)孔,反復(fù)進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。）觀察膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞侵襲情況。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

用于分析統(tǒng)計(jì)的軟件有sigmastat3.0、spss14.0,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s）表示。統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析(ANOVA）,多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與一個(gè)對(duì)照組比較采用最小顯著差法(LSD）,實(shí)驗(yàn)組之間比較采用q檢驗(yàn)(Newman-keuls test）(P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。

2 結(jié)果

2.1 Src shRNA表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

將重組Src shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α,提取的質(zhì)粒用BamHⅠ和PstⅠ內(nèi)切酶分別單酶切。PstⅠ酶切結(jié)果顯示有2條帶,一條為超螺旋的SC構(gòu)型,一條為質(zhì)粒的松弛開環(huán)的OC構(gòu)型。重組體被BamHⅠ單酶切而線性化,條帶大小為232 bp。送目的質(zhì)粒DNA由上海吉?jiǎng)P生物技術(shù)公司完成測(cè)序,T3 啟 動(dòng) 子 引 物 5′-AAGCTGTTCGGAGGCTTCAAC-3′(226-244 bp）,結(jié)果顯示插入序列與設(shè)計(jì)的shRNA堿基序列完全一致,無突變(圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響

U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,Src siRNA組與空對(duì)照組相比,RT-PCR測(cè)得Src表達(dá)明顯下降,Src+NEDD4-1組Src表達(dá)增強(qiáng),而NEDD4-1組幾乎無太大的變化。實(shí)驗(yàn)組Src shRNA組,Src+NEDD4-1組卻變化較大。并且Src shRNA水平的下調(diào)影響其本身以及NEED4-1的表達(dá)(圖1）。

2.3 Western blot分析U251細(xì)胞中Src蛋白的表達(dá)結(jié)果

Western blot方法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中Src的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)其Src較正常膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Src蛋白激酶被RNA干擾后的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞和未干擾的U251細(xì)胞相比,出現(xiàn)了明顯的G1/S期的阻滯及凋亡率的上升。同時(shí),Src蛋白表達(dá)缺失。而Src+NEDD4-1組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組Src蛋白表達(dá)在各組中最強(qiáng)。ND4組變化不大(圖2）。

圖1 Src shRNA ND4表達(dá)質(zhì)粒的PCR及酶切鑒定

圖2 轉(zhuǎn)染后Western Blot結(jié)果分析

2.4 Src介導(dǎo)NEDD4-1引起的膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移、侵襲性的變化

應(yīng)用劃痕法測(cè)定轉(zhuǎn)染的四組在U251細(xì)胞中遷移能力的變化(圖3-5）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染Src+ND4組16 h后向劃痕內(nèi)遷移的細(xì)胞侵襲距離較其他各組呈明顯增強(qiáng)趨勢(shì),而轉(zhuǎn)染 shRNA質(zhì)粒的U251細(xì)胞16 h后向劃痕內(nèi)遷移的細(xì)胞侵襲距離較其他各組明顯降低。這一發(fā)現(xiàn)提示Src shRNA抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力的作用中扮演關(guān)鍵的開關(guān)角色(如表1）。

表1 轉(zhuǎn)染各組膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵龔距離(±s）

表1 轉(zhuǎn)染各組膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵龔距離(±s）

干擾組與控制組比較,△P＜0.5,干擾組與Src+ND4組間比較,*P＜0.1

分組 侵襲距離(平均差±標(biāo)準(zhǔn)差）CONTROL 86.6±7.1 NEDD4-1 87.2±8.1 Src+NEDD4-1 90.80±10.2 ShR NA 34.9±7.2△*

圖3 Src介導(dǎo)下膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力的變化

圖4 T ranswell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞侵襲能力的變化

進(jìn)一步用Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞侵襲能力的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染Src與NEDD4-1質(zhì)粒在U251細(xì)胞的細(xì)胞侵襲性較轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照組明顯增強(qiáng)?？梢钥闯鯪EDD4-1與Src質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性,而在Src shRNA則通過抑制Src的作用進(jìn)而抑制U251細(xì)胞的侵襲性。

圖5 Src介導(dǎo)下膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移、侵襲性的變化

3 討論

我們?cè)诒磉_(dá)Src shRNA重組載體構(gòu)建成功的基礎(chǔ)上,對(duì)其抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Src基因表達(dá)的效果進(jìn)行檢測(cè),并觀察Src基因表達(dá)下降對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特征的影響。

從Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析細(xì)胞侵襲能力的變化看出:轉(zhuǎn)染的Src+NEDD4-1質(zhì)粒細(xì)胞組U251細(xì)胞侵襲性較其他各組明顯增強(qiáng),而Src shRNA通過抑制Src的活性進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的侵襲性。同時(shí),應(yīng)用劃痕法測(cè)定轉(zhuǎn)染的四組細(xì)胞中遷移變化得出的結(jié)果與Transwel實(shí)驗(yàn)相符?？梢钥闯鯯rc+NEDD4-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性。

Western blot實(shí)驗(yàn)表明膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系中Src蛋白的正常表達(dá)(見圖2）。應(yīng)用Src酪氨酸激酶抑制劑shRNA抑制U251細(xì)胞中Src酪氨酸激酶活化,能夠抑制Src的表達(dá);相反,NEDD4-1+Src組與其他三組相比Src蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)[8]。

同時(shí)大量的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)Src還作用于整合素依賴性粘附、細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白重排以及整合素基因表達(dá)調(diào)節(jié)及信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制中的二級(jí)分子[9]。各種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)Src腫瘤增值有促進(jìn)作用。對(duì)編碼無激酶活性形式的Src的DNA進(jìn)行顯微注射,或是壓制識(shí)別Src末端保守序列的抗體,都能抑制由GEF,PGDF和CSF誘導(dǎo)的DNA合成。此外,無活性的激酶或是缺少結(jié)構(gòu)域的Src突變體在Src的成纖維細(xì)胞中的表達(dá),也能阻斷PGDF誘導(dǎo)的DNA合成。Src的SHZ域是與PDGF受體結(jié)合所必需的;SH3域突變的Src突變體干擾了由PDGF和GEF所誘導(dǎo)的NDA合成,證明SH3域在這些生長因子誘導(dǎo)的DNA合成中有重要作用[10]。

與人膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的研究進(jìn)展較快,依據(jù)膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化障礙、膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展發(fā)生情況,已明確的基因包括KRa,Ink4a-Arfs,PDGF,RB,TP53等[11],尚未涉及到與Src的關(guān)系。本研究選擇Src作為靶基因,原因是它在神經(jīng)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞瘤惡變成多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤過程中,隨惡性程度增高而表達(dá)增加。從目前膠質(zhì)瘤起源細(xì)胞的研究進(jìn)展來看,這類腫瘤細(xì)胞來源于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的共同前體細(xì)胞,即神經(jīng)干/祖細(xì)胞的可能性很大[12]。而我們?cè)谌颂ツX來源的神經(jīng)干/祖細(xì)胞體外分化過程中又發(fā)現(xiàn)了它隨細(xì)胞分化程度增高而表達(dá)量下降。而Src在膠質(zhì)瘤體外細(xì)胞系高表達(dá),并隨惡性程度增高表達(dá)增高[13]。

Src蛋白激酶功能復(fù)雜,已經(jīng)明確的是機(jī)體細(xì)胞有絲分裂過程中起G1-S期的關(guān)鍵作用[14-15],細(xì)胞無論是走進(jìn)還是走出分裂周期都需要它的參與。在G1后期Src與cyclinB1結(jié)合形成有絲分裂促進(jìn)因子(MPF）,它的高表達(dá)是腫瘤細(xì)胞無限增殖的源動(dòng)力,已在多種腫瘤中檢測(cè)到它的高表達(dá)[16-17]。Src高表達(dá)還可以通過紡錘體檢查點(diǎn)的改變,促進(jìn)癌細(xì)胞染色體的不穩(wěn)定性[18],因此它又是腫瘤異質(zhì)性和惡性進(jìn)展的根源。我們?cè)谌四X膠質(zhì)瘤U251培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)Src shRNA的重組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,腫瘤細(xì)胞Src被表達(dá)干擾后,其侵襲能力顯著下降,增殖周期阻滯在G1/S期,凋亡比例增加。由此以反證法證明了Src在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用和作為病因分子的潛在靶基因治療的價(jià)值。

綜上所述,本研究對(duì)Src在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)、分布以及Src在NEDD4-1發(fā)揮作用過程中的角色及其下游信號(hào)分子進(jìn)行了初步研究揭示了:NEDD4-1通過Src在細(xì)胞的凋亡、腫瘤的發(fā)生及其侵襲性過程中發(fā)揮著重要作用。做為Src的抑制劑Src shRNA在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及對(duì)腫瘤細(xì)胞生長、侵襲作用可能成為膠質(zhì)瘤治療的又一靶點(diǎn)。而更為重要的是對(duì)NEDD4-1基于Src引發(fā)的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究則可能進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲的生物學(xué)信息,為最終揭示其生長、侵襲的機(jī)制提供依據(jù)。

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