王宇宏,劉 冰

(1.吉林省婦幼保健院 檢驗(yàn)科,吉林 長春 130051;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 輸血科,吉林 長春 130021）

新生兒溶血病(Hemolytic disease of newborn,HDN）最基本的病因是胎母血型不合的胎兒紅細(xì)胞進(jìn)入母體,刺激母體產(chǎn)生IgG類免疫性抗體,該類抗體能通過胎盤與胎兒紅細(xì)胞結(jié)合并使之破壞而發(fā)生溶血,?？蓪?dǎo)致新生兒黃疸、貧血、水腫等,嚴(yán)重者將造成新生兒生理缺陷甚至死亡[1]。HDN主要包括ABO血型及Rh血型等溶血病,但又以ABO血型不合HDN最為常見,其次為Rh血型系統(tǒng),其他血型系統(tǒng)導(dǎo)致的HDN較為少見[2,3],我國有研究表明ABOHDN占新生兒溶血病的85.8%[3]。HDN血清學(xué)檢測的“3項(xiàng)試驗(yàn)”:直接抗人球蛋白試驗(yàn)、游離抗體試驗(yàn)和抗體釋放試驗(yàn)對該病的診斷最具有價值,目前臨床常用傳統(tǒng)的試管抗人球蛋白試驗(yàn)(Coombs試驗(yàn)）進(jìn)行檢測,操作步驟多、時間長、結(jié)果不便于保存,作者對近年我院送檢的79例ABO-HDN患兒血液標(biāo)本以國產(chǎn)微柱凝膠試劑卡進(jìn)行3項(xiàng)試驗(yàn)的檢測,現(xiàn)將統(tǒng)計(jì)分析后的結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本我院送檢的疑似ABO-HDN的新生兒外周血標(biāo)本79例,患兒以黃疸或進(jìn)行性黃疸加重為主要癥狀,年齡為出生24 h內(nèi)至7天,其中61例為出生小于或等于5天的新生兒的標(biāo)本,18例為出生超過5天的標(biāo)本。79例標(biāo)本中男性42例、女性37例,患兒均為A型或B型,與其母均為ABO血型不合,母均為O型RhD陽性。

1.2 試劑儀器微柱凝膠法新生兒溶血病檢測卡Ⅰ(ABO、RhD血型復(fù)查,直接抗人球蛋白試驗(yàn)）、微柱凝膠法新生兒溶血病檢測卡 П(游離抗體試驗(yàn)、抗體釋放試驗(yàn)）、ABO標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞(0.8%）,以上均由長春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn);微柱凝膠免疫分析技術(shù)專用離心機(jī)和孵育器由長春博研醫(yī)學(xué)生物儀器公司生產(chǎn)。

1.3 檢測方法

1.3.1 血型復(fù)查及直接抗人球蛋白試驗(yàn) 取新生兒溶血病檢測卡Ⅰ(1-6管）加患兒0.8%紅細(xì)胞懸液 50 μ l,專用離心機(jī)離心5 min(900 rpm,2 min,1 500 rpm,3 min）,離心后觀察結(jié)果,以凝集紅細(xì)胞停留在膠表面或膠中為陽性。

1.3.2 游離抗體試驗(yàn)及抗體釋放試驗(yàn) 取新生兒溶血病檢測卡 П,將1-3管分別標(biāo)記為A細(xì)胞、B細(xì)胞、O細(xì)胞,將4-6管分別標(biāo)記為A細(xì)胞、B細(xì)胞、O細(xì)胞。游離抗體試驗(yàn)將患兒血清50μ l分別加入前3管;抗體釋放試驗(yàn)將患兒放散液50μ l分別加入后3管,患兒紅細(xì)胞放散液按文獻(xiàn)[4]制備。按標(biāo)記分別將0.8%A細(xì)胞、B細(xì)胞、O細(xì)胞懸液各50 μ l加入1-6管,置專用孵育器內(nèi)37℃孵育15 min,再放入專用離心機(jī)內(nèi)離心5 min(900 rpm,2 min,1 500 r/min,3 min）,離心后觀察,陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)同上。

1.3.3 通過新生兒溶血病3項(xiàng)試驗(yàn)判斷ABO-HDN的方法[5]直抗試驗(yàn)以出現(xiàn)凝集為陽性,游離和放散試驗(yàn)以檢出可以和新生兒紅細(xì)胞反應(yīng)的抗體為陽性;單項(xiàng)放散試驗(yàn)陽性及其他項(xiàng)目陽性同時合并放散試驗(yàn)陽性的結(jié)果均可判為ABO-HDN;直抗及游離試驗(yàn)1項(xiàng)陽性只能判定為ABO-HDN可疑陽性,兩者同時陽性可判為ABO-HDN。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 陽性率差異分析采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 79例疑似ABO-HDN樣本3項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果3項(xiàng)試驗(yàn)檢測陽性結(jié)果見表1。3項(xiàng)試驗(yàn)不同陽性的分布及結(jié)果判斷見表2,由表2結(jié)果中可見ABOHDN確診數(shù)為70例,陽性率88.61%,且確診病例抗體釋放試驗(yàn)均為陽性。

表1 79例樣本3項(xiàng)試驗(yàn)檢測陽性結(jié)果

表2 79例樣本3項(xiàng)試驗(yàn)不同陽性的分布及結(jié)果判斷

2.2 確診樣本中ABO血型分布及檢出抗體特異性結(jié)果見表3。確診ABO-HDN 70例,其中母-嬰血型O-A 者為33例,占47.14%,O-B者為37例,占52.86%,兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.46,P＞0.05）。

2.3 ABO-HDN陽性率與新生兒出生天數(shù)的關(guān)系結(jié)果見表4。出生天數(shù)小于或等于5天新生兒共61例,ABO-HDN的陽性率為95.08%,明顯高于出生天數(shù)大于5天者(共18例）的66.67%,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.48,P＜0.01）。

表3 確診樣本中ABO血型分布及檢出抗體特異性

表4 ABO-HDN陽性率與新生兒出生天數(shù)的關(guān)系

3 討論

我國漢族HDN絕大多數(shù)由ABO血型系統(tǒng)抗體引起,其中最多見的是母親為O型,胎兒為A型或B型。理論上母親A型,胎兒B型或AB型或母親B型,胎兒A型或AB型時也可以發(fā)病,但實(shí)際病例很少。關(guān)于A/B血型的發(fā)病率各地報道不一,與地區(qū)血型基因頻率分布不同有關(guān),也可由A/B抗原性強(qiáng)弱不同所致[6,7]。本研究結(jié)果顯示,在確診的70例ABO-HDN中,B型占52.86%,A型占47.14%,兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）,與文獻(xiàn)[8]報道相符。B型分布略高于A型,與本地區(qū)(吉林?。〢BO血型分布(A型25.18%,B型33.18%）規(guī)律相一致[9]。

新生兒ABO-HDN的確診依賴于血清學(xué)3項(xiàng)檢查[10]。直抗試驗(yàn)是檢查患兒紅細(xì)胞是否致敏了不完全抗體,但在ABO-HDN此項(xiàng)試驗(yàn)常反應(yīng)微弱甚至無法檢出[3],本研究結(jié)果直抗試驗(yàn)陽性率僅為35.44%,在3項(xiàng)試驗(yàn)中陽性率最低。考慮與ABO血型抗原在新生兒紅細(xì)胞膜上發(fā)育不完全,紅細(xì)胞上A、B抗原相對較少有關(guān)。游離抗體試驗(yàn)是檢測患兒血清中的游離抗體,該試驗(yàn)陽性提示繼續(xù)溶血的可能,本檢測結(jié)果該試驗(yàn)陽性率為78.48%,但因游離抗體只在出生后頭幾天存在,以后迅速消失,因此對晚期診斷意義不大,且如僅游離抗體陽性只表明患兒體內(nèi)有抗體而不一定致敏,不能據(jù)此確診[3]。而抗體釋放試驗(yàn)是從患兒紅細(xì)胞上釋放出抗體,與成人相同血型的紅細(xì)胞反應(yīng),陽性則提示存在溶血,本研究顯示該試驗(yàn)陽性率達(dá)到88.61%,遠(yuǎn)高于其他2項(xiàng)檢查。另外,本研究中79例樣本3項(xiàng)試驗(yàn)不同陽性的分布及結(jié)果判斷顯示,3項(xiàng)試驗(yàn)均陽性的為23例(占29.11%）,游離試驗(yàn)陰性同時直抗試驗(yàn)與釋放試驗(yàn)陽性的5例(占6.33%）,單項(xiàng)釋放試驗(yàn)陽性的3例(占3.80%）,值得注意的是ABO-HDN患兒的紅細(xì)胞上雖然結(jié)合了其母不完全抗體,但直抗試驗(yàn)陰性,這并不表示其紅細(xì)胞上沒有結(jié)合抗體,可能只是抗體較少不足以和抗人球蛋白產(chǎn)生可見的反應(yīng),將其放散液做間接抗人球蛋白試驗(yàn)(即釋放試驗(yàn)）則可表現(xiàn)為陽性結(jié)果,此種情況即直抗試驗(yàn)陰性同時游離試驗(yàn)與釋放試驗(yàn)陽性的比例最多為39例(占49.37%）。在根據(jù)3項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果確診ABO-HDN的判斷方法中,僅一種陽性分布沒有出現(xiàn),即釋放試驗(yàn)陰性同時直抗與游離試驗(yàn)陽性,考慮到診斷ABO-HDN的最有力證據(jù)是證實(shí)患兒紅細(xì)胞被來自母親的IgG抗A(B）所致敏[4],此種情況下患兒紅細(xì)胞已致敏了不完全抗體,且血清中亦存在游離的抗體,理論上釋放試驗(yàn)應(yīng)該是陽性,故可以確診,有研究認(rèn)為[11]此種結(jié)果與制備放散液沒有控制好時間和溫度有關(guān),導(dǎo)致釋放試驗(yàn)假陰性。本研究結(jié)果顯示,79例疑似ABO-HDN樣本中,確診的70例樣本抗體釋放試驗(yàn)均為陽性,以上都說明在ABO-HDN的溶血3項(xiàng)試驗(yàn)中,以抗體釋放試驗(yàn)最為重要、敏感度最高,是診斷ABO-HDN最有力的證據(jù)[12]。

報告顯示[4],在ABO-HDN的檢測中,溶血3項(xiàng)試驗(yàn)陽性率與采血時機(jī)有很大關(guān)系,患兒的血清學(xué)檢查最好在出生后3-7天進(jìn)行,以防止致敏的紅細(xì)胞大部分被破壞,從而使真正的ABO-HDN漏檢?？梢?ABO-HDN的檢出率與新生兒出生時間有關(guān),其篩查試驗(yàn)就是要快速檢測出新生兒紅細(xì)胞上的IgG類抗體,為避免可能出現(xiàn)的“高膽紅素血癥”及其他危及新生兒的嚴(yán)重后遺癥,故臨床上對ABO-HDN患兒應(yīng)做到盡量早發(fā)現(xiàn)早作檢測以確診。本研究結(jié)果表明,出生天數(shù)小于或等于5天新生兒ABO-HDN的陽性率為95.08%,明顯高于出生天數(shù)大于5天新生兒的66.67%,兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01）。因此,母嬰ABO血型不合并發(fā)生新生兒黃疸的疑似ABO-HDN患兒,應(yīng)盡早送檢且最好采用出生5天內(nèi)的標(biāo)本,可提高陽性指標(biāo)的檢出率,以明確診斷從而避免延誤治療。

在ABO-HDN血清學(xué)檢查中,除血型鑒定外,其他均是以抗人球蛋白試驗(yàn)(Coombs試驗(yàn)）為技術(shù)手段的IgG類抗體檢測。傳統(tǒng)的試管法Coombs試驗(yàn)檢測IgG類抗體及直抗試驗(yàn)步驟多、操作繁瑣費(fèi)時,且受時間、凝集強(qiáng)度等因素的影響,結(jié)果判定有一定難度。當(dāng)前,以微柱凝膠技術(shù)為代表的一批微試管柱凝集技術(shù)在國外已成為常規(guī)的紅細(xì)胞血型血清學(xué)檢測方法,國內(nèi)有研究表明[13],采用國產(chǎn)微柱凝膠免疫檢測試劑卡進(jìn)行ABO-HDN血清學(xué)系列試驗(yàn),結(jié)果可靠與臨床診斷符合率達(dá)98%,ABO-HDN陽性檢出率顯著高于同時平行采用的試管法,認(rèn)為該國產(chǎn)微柱凝膠方法為新生兒溶血病實(shí)驗(yàn)室診斷提供了可靠依據(jù)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果,通過應(yīng)用國產(chǎn)微柱凝膠試劑卡進(jìn)行ABO-HDN 3項(xiàng)試驗(yàn)的檢測,顯示該方法能快速準(zhǔn)確檢測出ABO-HDN,且操作簡便,結(jié)果可保存,值得臨床推廣。

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