劉艷紅,章秀麗,陳少文,趙燕穎

(1.深圳市蛇口人民醫(yī)院,廣東深圳 518067;2.吉林大學(xué)第四醫(yī)院,吉林 長春 130011）

人參具有抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、增強(qiáng)免疫力等多種生物學(xué)活性。人參皂苷是人參中主要的活性成分。人參皂苷單體Rh2(G-Rh2）是從紅參中分離得到的原人參二醇型單糖鏈皂苷單體化合物,在一些腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)系中觀察到其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用[1-5],并初步探討該過程與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及阻滯細(xì)胞周期等有關(guān)。而目前缺少關(guān)于G-Rh2對(duì)肝癌細(xì)胞增殖抑制及其相關(guān)分子機(jī)制的研究報(bào)道。本研究以人肝癌細(xì)胞株HepG2為研究對(duì)象,觀察不同濃度G-Rh2誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用,并初步探討其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑G-Rh2由吉林大學(xué)分析化學(xué)教研室提供,純度大于99%;1640培養(yǎng)基和新生小牛血清(FBS）購自杭州四季青生物有限公司;MTT購自Sigma公司。survivin引物由上海生工生物技術(shù)公司合成,Trizol試劑,M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,PCR試劑盒均購自Invitrogen公司,紫外凝膠顯像儀(美國）。

1.2 細(xì)胞來源及培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系(HepG2）細(xì)胞購自于上海中科院細(xì)胞庫室,經(jīng)常規(guī)復(fù)蘇后培養(yǎng)和維持在體積分?jǐn)?shù)為10%FBS的1640培養(yǎng)液里,置CO2培養(yǎng)箱(37℃,5%CO2）培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞經(jīng)24 h無血清培養(yǎng)后,分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長抑制取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以密度為3×105/ml,接種于96孔培養(yǎng)板、每孔100 μ l。細(xì)胞貼壁后隨機(jī)分組 ,空白組、G-Rh2(5、10、20 mg/L）組 ,G-Rh2(10 mg/L）給藥 24、48、72 h組。每一濃度均設(shè)3個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)有對(duì)照孔。培養(yǎng)結(jié)束前加MTT(5 g/L）15 μ l,繼續(xù)孵育4 h后每孔加 150 μ l DMSO,震蕩 10 min,用酶標(biāo)儀測(cè)定 570 nm各孔光吸收值(A值）。計(jì)算細(xì)胞生長抑制率,抑制率≥30%為細(xì)胞對(duì)該藥敏感。細(xì)胞生長抑制率(%）=(1-加藥組A值/對(duì)照組A值）×100%

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及周期對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后傳代接種于培養(yǎng)瓶中,每瓶細(xì)胞1×106,24 h后加藥,G-Rh2終濃度為5 mg/L、10 mg/L和 20 mg/L,對(duì)照組加等體積PBS,各瓶終體積為4 ml,72 h后收集各組細(xì)胞,用冷PBS(pH 7.2）清洗2次,70%的冷乙醇4℃固定24 h。用FACStarpous流式細(xì)胞儀檢測(cè),計(jì)算凋亡率和各期細(xì)胞所占比例。

1.5 RT-PCR檢測(cè)基因變化對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞按每瓶細(xì)胞1×106接種,24 h后向后兩組細(xì)胞加藥(分組同1.4）,繼續(xù)培養(yǎng)72 h后收集全部四組細(xì)胞,按Trizol操作說明,提取RNA,紫外分光光度計(jì)定量。RNA樣品經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以GAPDH為內(nèi)參,觀察survivin mRNA表達(dá)情況。survivin擴(kuò)增產(chǎn)物為466 bp:上游引物為5′-TTGGCAGGTGCCTGTTGAAT-3′;下 游 引 物 為 5′-AGCCAGTCCCCCACAGCAT-3′。GAPDH 擴(kuò)增產(chǎn)物為309 bp,上游引物為 :5′-GG2 GAAACTGTGGCGTGAT-3′下游引 物為 :5′-AAAGGTGGAG2 GAGTGGGT-3′。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠系統(tǒng)電泳(含溴化 乙啶）,拍照鑒定和分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,使用 χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 G-Rh2對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響對(duì)照組細(xì)胞體外生長活躍,經(jīng)5、10及20mg/L G-Rh2作用后,HepG2細(xì)胞增殖均有不同程度受到抑制,與陰性對(duì)照組比較差異具有顯著性(P＜0.01）,且Rh2對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞生長抑制影響呈劑量依賴性,和時(shí)間依賴性。增殖抑制率隨著G-Rh2劑量增加而增加;加用10 mg/L G-Rh2后24、48及72 h的細(xì)胞增殖抑制率隨時(shí)間延長而增加。如圖1。

圖1 G-Rh2對(duì)hepG2細(xì)胞的增殖抑制作用

2.2 G-Rh2對(duì)HepG2細(xì)胞周期及凋亡率的影響3種濃度的G-Rh2作用HepG2細(xì)胞72 h后,可影響細(xì)胞周期分布,G0/G1期和G2/M期細(xì)胞百分比上升,S期細(xì)胞百分比下降,細(xì)胞凋亡率隨藥物劑量增加而逐漸增加,詳見表1。

2.3 G-Rh2對(duì)HepG2細(xì)胞survivin mRNA表達(dá)的影響Survivin和GAPDH擴(kuò)增片段長度分別為466 bp和309 bp。5,10,20 mg/L G-Rh2組 survivin表達(dá)抑制率為41.02%,61.16%和88.69%。對(duì)survivin基因表達(dá)抑制率隨G-Rh2劑量增加而增加,詳見圖2。

表1 G-Rh2作用HepG2細(xì)胞后細(xì)胞周期和凋亡率的變化(n=4,±s）

表1 G-Rh2作用HepG2細(xì)胞后細(xì)胞周期和凋亡率的變化(n=4,±s）

*P＜0.05 VS control

細(xì)胞周期 G0/G1 S G2/M 凋亡率(%）別 組control 57.3±1.1 21.6±3.2 21.1±0.8 4.0±0.19 5 mg/L 59.5±0.9 16.2±2.9 24.3±1.1* 19.5±2.02*10 mg/L 60.9±0.6 11.6±3.1 27.5±2.1* 26.8±3.11*20 mg/L 63.2±1.1 4.9±3.7 31.9±1.1* 46.9±2.12*

圖2 G-Rh2對(duì)hepG2細(xì)胞的survivin mRNA表達(dá)的影響

3 討論

人參皂苷是人參的主要活性成分,在人參皂苷單體中G-Rh2的抑瘤活性最強(qiáng),體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明G-Rh2時(shí)間和劑量依賴性地抑制宮頸癌[6]、腦膠質(zhì)瘤[7]、肺癌[8]等多種腫瘤細(xì)胞的增殖,且其誘導(dǎo)凋亡與抑制增殖呈正相關(guān),但目前未見G-Rh2對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2增殖抑制作用的研究。Kim等[9]研究表明G-Rh2有誘導(dǎo)小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用。馬文彬等應(yīng)用流式細(xì)胞儀研究G-Rh2對(duì)S180肉瘤細(xì)胞周期移行的影響,發(fā)現(xiàn)GS-Rh2能引起細(xì)胞周期阻滯于S期。為進(jìn)一步探討G-Rh2抑制細(xì)胞生長的機(jī)理,我們檢測(cè)了G-Rh2作用后HepG2細(xì)胞凋亡率(AR）以及細(xì)胞周期變化。結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明G-Rh2可以使腫瘤細(xì)胞周期阻滯,G1期細(xì)胞增多,S期細(xì)胞減少,G2/M期細(xì)胞相對(duì)增多,抑制細(xì)胞G1期的RNA合成,從而延緩腫瘤細(xì)胞的增殖,GRh2可使HepG2細(xì)胞G1期阻滯,不能進(jìn)入S期,阻滯G1期細(xì)胞向S期的轉(zhuǎn)化進(jìn)程,從而使G2/M期細(xì)胞相對(duì)增多。HepG2細(xì)胞的凋亡率在一定范圍內(nèi)具有隨藥物濃度增高而增高的趨勢(shì)。由此提示:在一定范圍內(nèi),G-Rh2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性。

Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制蛋白(inhibition apoptosis protein,IAP）,在正常組織、終末分化組織中表達(dá)陰性,而在絕大多數(shù)腫瘤組織中表達(dá) 陽性,與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)[10-12]。其作用機(jī)制與IAP家族的其他蛋白相似,系通過抑制caspase-3和7酶原的活性,抑制細(xì)胞凋亡;另外,Survivin還通過與紡錘體纖維的結(jié)合,間接地抑制caspase酶對(duì)紡錘體的水解作用,保護(hù)有絲分裂細(xì)胞器的完整性,發(fā)揮抑制細(xì)胞的凋亡的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),GS-Rh2能抑制肝癌HepG2細(xì)胞Survivin基因的表達(dá),而且隨著藥物濃度的增加,對(duì)Survivin基因的表達(dá)的抑制作用也增加。G-Rh2在體外對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2有明顯的增殖抑制作用和凋亡誘導(dǎo)作用,初步推斷其對(duì)survivin mRNA表達(dá)的抑制可能是G-Rh2誘發(fā)肝癌細(xì)胞凋亡的主要原因之一。但對(duì)其作用機(jī)理仍需進(jìn)一步的探討。

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