夏 莉,劉玉俠,遲艷飛,王 娟,高 峰,李 嵐,于 軍,劉柏林

(1.吉林省人民醫(yī)院 腫瘤科,吉林 長春 130021;2.吉林省腫瘤防治研究所,吉林 長春 130012）

T細(xì)胞可依據(jù)表面受體(TCR）的不同表達(dá)而分成兩類:TCRα β 細(xì)胞和TCRγ δ細(xì)胞 。其中 γ δ T 細(xì)胞是一個數(shù)量較小的亞群,約占正常人外周血T淋巴細(xì)胞總數(shù)的1%-10%。在腫瘤免疫中γ δ T細(xì)胞對腫瘤抗原的識別不具組織相容性抗原復(fù)合體(MHC）限制性及不需特異的抗原呈遞作用,且對多種腫瘤細(xì)胞具細(xì)胞毒活性。

為深入研究γ δT細(xì)胞在肝癌免疫治療中的作用,我們采用T 細(xì)胞受體γ δ T 單抗,IL-2,HSP70體外選擇性擴增正常人外周血γ δ T細(xì)胞,并制備和鑒定HSP70-抗原肽復(fù)合物,體外誘導(dǎo)γ δT細(xì)胞生成,比較不同誘導(dǎo)方法γ δ T細(xì)胞的產(chǎn)生率,為進一步研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

IMDM、MTT:Sigma公司;胎牛血清:杭州四季青生物工程材料有限公司;PE anti-human γ δ T Cell Receptor(B1）:BioLegend;抗 TCRγ δ單抗 :Immunotech;IL-2:北京四環(huán)生物制藥有限公司;淋巴細(xì)胞分離液:中國科學(xué)院血液學(xué)研究所;蛋白分子量Marker:中國科學(xué)院上海生命研究所。

1.2 方法

1.2.1 HSP70-抗原肽復(fù)合物的制備及鑒定 取對數(shù)生長期的SMMC-7721細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化,調(diào)細(xì)胞濃度為1×107/ml,43℃水浴熱休克2 h,37℃恢復(fù) 2 h,反復(fù)凍融(-196℃,37℃）細(xì)胞 3次,高速離心(15 000 r/min,1 h）,收獲上清液,用紫外分光光度計測蛋白濃度,0.22 μ m濾器除菌,-80℃冰箱分裝凍存。

1.2.2 外周血淋巴細(xì)胞的分離:按說明書進行。

1.2.3 γ δ T細(xì)胞誘導(dǎo)方法 將分離的淋巴細(xì)胞接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,1×105/ml,1 ml/孔,按以下順序分組并加細(xì)胞因子,每3天半量換液。

第 1 組 :γ δ T cell receptor(0.4 μ g/ml）

第 2 組 :γ δT cell receptor(0.4 μ g/ml）+IL-2(300 U/ml）

第 3 組 :γ δT cell receptor(0.4 μ g/ml）+HSP70(20 μ g/ml）

第 4 組 :γ δT cell receptor(0.8 μ g/ml）

第 5 組 :γ δT cell receptor(0.8 μ g/ml）+IL-2(300 U/ml）

第 6 組 :γ δT cell receptor(0.8 μ g/ml）+HSP70(20 μ g/ml）

第7 組 :HSP70(20 μ g/ml）+IL-2(300 U/ml）

1.2.4 γ δ T細(xì)胞鑒定 取加不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)的γ δ T 細(xì)胞,離心(1 000 rpm,5min）后用PH7.2 PBS 洗1次,1 000 rpm,5 min,調(diào)細(xì)胞數(shù)大約5～10×105/管/100 μ l,加 PE 標(biāo)記的 γ δT cell單抗 20 μ l,冰上 15 min,避光,PBS洗2次,每次至少 2 ml體積,最后加PBS 500 μ l,懸起,行流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié)果

我們對誘導(dǎo)的γ δT細(xì)胞在培養(yǎng)的第6天進行檢測、鑒定,結(jié)果見圖1-7。

圖 1 γ δ(0.4 μ g）

圖 2 γ δ(0.4 μ g）+IL-2

圖 3 γ δ(0.4 μ g）+HSP70

圖 4 γ δ(0.8 μ g）

圖 5 γ δ(0.8 μ g）+IL-2

圖 6 γ δ(0.8 μ g）+HSP70

圖 7 HSP70+IL-2

圖 1 γ δ(0.4 μ g）:可誘導(dǎo) γ δ T 細(xì)胞的大量產(chǎn)生 ,達(dá) 61.5%;圖 2 γ δ(0.4 μ g）+IL-2:達(dá) 62.1%;圖 3 γ δ(0.4ug）+HSP70:達(dá) 71.1%;圖 4 γ δ(0.8 μ g）:達(dá)75.7%;圖 5 γ δ(0.8 μ g）+IL-2:達(dá) 79.2%;圖 6 γ δ(0.8 μ g）+HSP70:達(dá) 85.6%;圖 7 HSP70+IL-2:達(dá)75.6%。

圖8 不同方法誘導(dǎo)人外周血γ δ T細(xì)胞的比較

γ δ T cell receptor(0.4 μ g/ml）即可誘導(dǎo) γ δ T 細(xì)胞的大量產(chǎn)生,達(dá) 61.5%,在 0.8 μ g/ml時進一步升高,達(dá)75.7%;當(dāng)與IL-2聯(lián)合應(yīng)用時產(chǎn)生率無明顯變化;在與HSP70聯(lián)合使用時,產(chǎn)量明顯升高,分別達(dá)71.1%和85.6%;HSP70與IL-2聯(lián)合使用也可以產(chǎn)生大量 γ δ T 細(xì)胞 ,達(dá)75.6%。

3 討論

γ δT細(xì)胞是Brenner等[1]于 1986年首先發(fā)現(xiàn),在正常人外周血中約占T細(xì)胞的1%-10%。γ δT細(xì)胞既可作為免疫應(yīng)答效應(yīng)細(xì)胞,也可作為免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)細(xì)胞。在機體抗感染、抗腫瘤、免疫監(jiān)視、免疫調(diào)節(jié)以及專職的抗原呈遞方面都起著重要的作用[2,3]。γ δT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的機制與CTL細(xì)胞和NK細(xì)胞相似,主要通過穿孔素、顆粒酶和Fas/FasL途徑起作用。Campillo等[4]證實,由人外周血培養(yǎng)的γ δT細(xì)胞具有較強的抗腫瘤作用。陳復(fù)興等[5]研究結(jié)果表明:從人外周血分離培養(yǎng)出的γ δ T細(xì)胞對消化道系統(tǒng)常見腫瘤細(xì)胞均有較強的殺傷作用。Kabelitz等[6,7]用正常人外周血體外擴增的γ δ T細(xì)胞對黑色素瘤細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞進行體內(nèi)外抗腫瘤實驗發(fā)現(xiàn),γ δ T細(xì)胞具有顯著的抑瘤作用,表明人外周血γ δ T細(xì)胞可以發(fā)揮有效的腫瘤殺傷作用。

熱休克蛋白(Heat Shock Proteins,HSP）具有高度保守性,在不同生物種屬中有70%以上的同源結(jié)構(gòu),因而具有廣泛的生物學(xué)意義。作為分子伴侶,HSPs參與其他蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運、合成等過程。在免疫應(yīng)答中HSPs不僅能攜帶特異性腫瘤抗原,將其轉(zhuǎn)交給MHCⅠ、Ⅱ類分子,還可作為抗原呈遞分子直接將抗原肽呈遞給γ δ T細(xì)胞,使其活化、增殖,發(fā)揮細(xì)胞毒和分泌細(xì)胞因子雙重功能。

雖然γ δ T細(xì)胞在細(xì)胞免疫中具有重要作用,但是由于在外周血中含量較低,使其不能發(fā)揮應(yīng)有的作用。本實驗通過用不同方法在體外擴增γ δT細(xì)胞,使其大量產(chǎn)生,以發(fā)揮其抗腫瘤作用。

我們在實驗中分別比較了不同濃度γ δ T cell receptor,γ δ T cell receptor 聯(lián)合 HSP70 、IL-2 對 γ δT cell產(chǎn)生的影響。從我們的實驗中可以看出,外周血淋巴細(xì)胞經(jīng) γ δT cell receptor、HSP70 、IL-2 誘導(dǎo)后 ,其產(chǎn)生率達(dá)到61%以上,最高達(dá)到85.6%(0.4 μ g/ml）細(xì)胞 ,其中以 γ δT cell receptor(0.8 μ g/ml）聯(lián)合 HSP70(20 μ g/ml）的產(chǎn)生率最高,達(dá) 85.6%。我們的實驗證明,用 γ δ T cell receptor誘導(dǎo) γ δ T cell的產(chǎn)生方法簡單易行 ,在 0.8 μ g/ml時可以得到高產(chǎn)量的 γ δT細(xì)胞,而且在與HSP70聯(lián)合誘導(dǎo)后,產(chǎn)量進一步增加,為其抗腫瘤實驗以及其它的實驗奠定了基礎(chǔ)。

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