包東武，李建華

（南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，河南南陽(yáng)473000）

厭氧芽胞梭菌標(biāo)本的制作

包東武，李建華

（南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，河南南陽(yáng)473000）

厭氧芽胞梭菌；分離培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)教學(xué)

厭氧芽胞梭菌由于來(lái)源困難，臨床標(biāo)本較少，為此，我們從土壤中分離厭氧芽胞梭菌中的破傷風(fēng)芽胞梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和肉毒梭菌，制備菌種、芽胞和莢膜標(biāo)本片，用于臨床檢驗(yàn)專(zhuān)業(yè)的厭氧芽胞梭菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)及其他專(zhuān)業(yè)芽胞和莢膜特殊結(jié)構(gòu)形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)，取得了良好的實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果，其分離制備過(guò)程如下。

1 材料和方法

1.1 儀器及材料

電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴箱、水浴鍋、電爐、庖肉培養(yǎng)基、血平培養(yǎng)基、普通瓊脂平板培養(yǎng)基、焦性沒(méi)食子酸、10%氫氧化鈉溶液、紗布、石蠟、無(wú)菌毛細(xì)滴管、注射器、載玻片、染色液、中性樹(shù)膠、蓋玻片、標(biāo)本盒、小白鼠等。

1.2 方法

1.2.1 接種標(biāo)本增菌培養(yǎng)取10支庖肉培養(yǎng)基管放入水浴鍋中煮沸20分鐘，以除去培養(yǎng)基管內(nèi)的氧氣；把庖肉培養(yǎng)基上層的石蠟在酒精燈上烤化，分別將一豆粒大小的土塊（花池中的土塊更好）放入培養(yǎng)基管內(nèi)搖勻；將培養(yǎng)基放入80℃水浴箱內(nèi)20分鐘，以除去土壤中的雜菌；取出培養(yǎng)管并放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)24～48小時(shí)。

1.2.2 分離培養(yǎng)取出庖肉培養(yǎng)基，可見(jiàn)培養(yǎng)管變渾濁，管底肉渣可能部分被消化或變色，產(chǎn)生氣體，有腐敗惡臭味。選用肉湯輕度渾濁，肉渣部分消化呈微黑色，并產(chǎn)生少量氣體，有腐敗惡臭味的培養(yǎng)管內(nèi)的培養(yǎng)物分離破傷風(fēng)芽胞梭菌；選用肉湯渾濁，肉渣未被消化，但變?yōu)榉奂t色，產(chǎn)生大量氣體，將培養(yǎng)管上層的石蠟沖開(kāi)的培養(yǎng)管內(nèi)的培養(yǎng)物分離產(chǎn)氣莢膜梭菌；選用肉湯渾濁，肉渣消化變黑色，產(chǎn)生氣體，有腐敗惡臭味的培養(yǎng)管內(nèi)的培養(yǎng)物分離肉毒梭菌。將以上培養(yǎng)物分別分離劃線(xiàn)接種于血平板培養(yǎng)基和普通平板培養(yǎng)基上，于平皿蓋外部中央放2層紗布，中間包夾1g焦性沒(méi)食子酸，加10%氫氧化鈉溶液1ml于紗布上，迅速將接種好的平板培養(yǎng)基反轉(zhuǎn)扣在紗布上（紗布直徑應(yīng)小于培養(yǎng)基，且不能與培養(yǎng)基表面接觸），并用熔化的石蠟封固外周，放37℃培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)24～48小時(shí)，或直接把接種后的平板培養(yǎng)基直接放入37℃厭氧培養(yǎng)箱或厭氧罐中培養(yǎng)。

1.2.3 菌種鑒定（1）破傷風(fēng)芽胞梭菌的鑒定。破傷風(fēng)芽胞梭菌在普通培養(yǎng)基上，形成不規(guī)則的圓形，中心實(shí)周邊松似羽毛細(xì)絲，邊緣呈鋸齒狀的扁平菌落（在血平板上易呈遷徙狀生長(zhǎng)，不易獲得單個(gè)菌落，應(yīng)提高瓊脂的濃度）。涂片革蘭氏染色，油鏡觀察可見(jiàn)革蘭陽(yáng)性細(xì)長(zhǎng)桿菌，一般為（2～3）μm×（0.3～0.5）μm，芽胞位于菌體的一端，圓形，大于菌體，似鼓槌狀。生化反應(yīng)不分解糖類(lèi)，能液化明膠，產(chǎn)生硫化氫，大多數(shù)菌株吲哚實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性[1]。（2）產(chǎn)氣莢膜梭菌的鑒定。產(chǎn)氣莢膜梭菌在血平板上形成2～4mm、圓形、凸起、表面光滑、灰白色、不透明、邊緣整齊的菌落，大多數(shù)菌株的菌落近周有完全溶血環(huán)，其外又有較寬的不完全溶血環(huán)，形成雙層溶血。取典型菌落做革蘭染色油鏡觀察，可見(jiàn)兩端鈍圓，大小為（1～1.5）μm×（3～5）μm的革蘭陽(yáng)性粗大桿菌，單個(gè)或成雙存在，可見(jiàn)橢圓形芽胞形位于菌體中央或次極端，直徑小于菌體的寬度。生化反應(yīng)，本菌能分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖和蔗糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不分解甘露醇，做洶涌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)6小時(shí)出現(xiàn)明顯的陽(yáng)性反應(yīng)[2]。（3）肉毒梭菌的鑒定。肉毒梭菌在血平板培養(yǎng)24小時(shí)，可形成2～4mm白色粗糙的有透明溶血環(huán)的菌落，取典型菌落進(jìn)行革蘭染色油鏡觀察，可見(jiàn)革蘭陽(yáng)性粗短桿菌，兩端鈍圓，大小為（1～1.2）μm×（4～6）μm，單獨(dú)或成雙排列，有時(shí)可成短鏈狀排列。芽胞呈橢圓形，位于菌體次極端，寬于菌體，使菌體呈湯匙狀或網(wǎng)球拍狀。生化反應(yīng)，本菌分解葡萄糖和麥芽糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不發(fā)酵乳糖，液化明膠，產(chǎn)生H2S，但不產(chǎn)生吲哚[2]。

1.2.4 純培養(yǎng)及菌種保存分別將鑒定后的菌種轉(zhuǎn)種于另一血平板培養(yǎng)基，用上述方法置37℃厭氧培養(yǎng)24～48小時(shí)，再分別轉(zhuǎn)種庖肉培養(yǎng)基各2支，放入37℃培養(yǎng)箱18小時(shí)，取出做菌種，放4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 芽胞標(biāo)本片的制備（1）破傷風(fēng)梭菌芽胞標(biāo)本片的制備。將破傷風(fēng)梭菌接種于庖肉培養(yǎng)基中，放37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48小時(shí)；取出觀察培養(yǎng)管變輕度渾濁，用無(wú)菌毛細(xì)吸管滴加菌液1滴于潔凈玻片上，用接種環(huán)涂勻，干燥固定；用片夾夾住玻片的一端，滴加石炭酸復(fù)紅液（抗酸染色第一液）3滴左右，蓋滿(mǎn)涂膜，并以弱火微加熱使染液出現(xiàn)微汽即可，且勿煮沸燒干，染液將干時(shí)，應(yīng)隨時(shí)添加，持續(xù)染色3～5分鐘，待標(biāo)本片冷卻后水沖洗；加95%酒精脫色2分鐘，水沖洗；加堿性美蘭液（抗酸染色第三液）復(fù)染1分鐘，水沖洗；吸水后油鏡觀察，可見(jiàn)破傷風(fēng)梭菌菌體被染成藍(lán)色，芽胞被染成紅色，圓形，位于菌體的極端，膨大，似鼓槌狀。用此法大批制片，染色后加蓋片用中性樹(shù)膠封固，晾干后貼標(biāo)簽長(zhǎng)期保存使用。（2）產(chǎn)氣莢膜梭菌芽胞標(biāo)本片的制備。將產(chǎn)氣莢膜梭菌接種于不含糖的庖肉培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)箱24小時(shí)；取出觀察培養(yǎng)管變渾濁，涂片芽胞染色（同破傷風(fēng)芽胞梭菌芽胞染色）；油鏡觀察，可見(jiàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌芽胞被染成紅色，卵圓形，位于菌體的中央或次極端，不膨大，菌體染成藍(lán)色。用此法大批制片，長(zhǎng)期保存使用。（3）肉毒梭菌芽胞標(biāo)本片的制備。將肉毒梭菌接種于庖肉培養(yǎng)基中，放37℃培養(yǎng)箱24小時(shí)；取出觀察培養(yǎng)管變渾濁，涂片芽胞染色（同破傷風(fēng)芽胞梭菌的芽胞染色）；油鏡觀察，可見(jiàn)肉毒梭菌菌體被染成藍(lán)色，芽胞被染成紅色，卵圓形，位于菌體的次極端，膨大，似網(wǎng)球拍狀。用此法大批制片，長(zhǎng)期保存使用。

1.2.6 莢膜標(biāo)本片制備將產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)18小時(shí)的液體培養(yǎng)物0.5ml注射入小白鼠腹腔，10分鐘后殺死小白鼠，置37℃溫箱4～6小時(shí)，由于產(chǎn)氣莢膜桿菌產(chǎn)生大量氣體，可使小白鼠體內(nèi)充滿(mǎn)氣體，腹部膨脹，剖檢可見(jiàn)各臟器腫脹，并有許多氣泡，尤以肝臟為甚。剖開(kāi)肝臟進(jìn)行涂片，干燥固定；用石炭酸復(fù)紅液染色1分鐘，并用微火稍微加熱，待標(biāo)本放涼后水沖洗；加特殊媒染劑（升汞飽和液2份、20%鞣酸液2份、鉀明礬飽和液1份混合而成）作用0.5分鐘，水沖洗；最后用堿性美蘭液染色1分鐘，水沖洗；吸水后油鏡觀察，結(jié)果為菌體被染成鮮明紅色，莢膜呈藍(lán)色，位于菌體外周。亦可將涂片直接用革蘭氏染色法進(jìn)行染色，結(jié)果菌體呈紫色，莢膜呈透明圈，位于菌體外周。用此法大批制片，染色后加蓋片用中性膠封固，晾干后貼標(biāo)簽，放入標(biāo)本盒內(nèi)長(zhǎng)期保存使用。

2 結(jié)果

從土壤中分離出的厭氧芽孢梭菌制備的菌種及芽胞和莢膜標(biāo)本片均非常典型。菌種用于臨床檢驗(yàn)專(zhuān)業(yè)的厭氧芽胞梭菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和洶涌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，芽胞和莢膜標(biāo)本片用于臨床醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)及其他醫(yī)學(xué)類(lèi)各專(zhuān)業(yè)的細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)觀察實(shí)驗(yàn)，取得了非常好的實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果。

3 討論

近幾年來(lái)厭氧芽孢梭菌引起的感染及食物中毒病例明顯增多，細(xì)菌的耐藥性也在不斷增高，這給臨床醫(yī)生治療帶來(lái)了很大困難，應(yīng)引起高度重視。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，臨床標(biāo)本來(lái)源有限，但從土壤中分離厭氧芽孢梭菌比較方便，操作簡(jiǎn)單，制備的標(biāo)本片形態(tài)典型，可廣泛應(yīng)用于病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

[1]陳興保.病原生物學(xué)和免疫學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2007.

[2]劉榮臻.微生物學(xué)檢驗(yàn)[M].北京：高等教育出版社，2007.

G424.31

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1671-1246（2011）03-0096-02