包東武，李建華

（南陽醫(yī)學高等專科學校，河南南陽473000）

厭氧芽胞梭菌標本的制作

包東武，李建華

（南陽醫(yī)學高等?？茖W校，河南南陽473000）

厭氧芽胞梭菌；分離培養(yǎng)；實驗教學

厭氧芽胞梭菌由于來源困難，臨床標本較少，為此，我們從土壤中分離厭氧芽胞梭菌中的破傷風芽胞梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和肉毒梭菌，制備菌種、芽胞和莢膜標本片，用于臨床檢驗專業(yè)的厭氧芽胞梭菌培養(yǎng)實驗及其他專業(yè)芽胞和莢膜特殊結構形態(tài)觀察實驗，取得了良好的實驗教學效果，其分離制備過程如下。

1 材料和方法

1.1 儀器及材料

電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴箱、水浴鍋、電爐、庖肉培養(yǎng)基、血平培養(yǎng)基、普通瓊脂平板培養(yǎng)基、焦性沒食子酸、10%氫氧化鈉溶液、紗布、石蠟、無菌毛細滴管、注射器、載玻片、染色液、中性樹膠、蓋玻片、標本盒、小白鼠等。

1.2 方法

1.2.1 接種標本增菌培養(yǎng)取10支庖肉培養(yǎng)基管放入水浴鍋中煮沸20分鐘，以除去培養(yǎng)基管內(nèi)的氧氣；把庖肉培養(yǎng)基上層的石蠟在酒精燈上烤化，分別將一豆粒大小的土塊（花池中的土塊更好）放入培養(yǎng)基管內(nèi)搖勻；將培養(yǎng)基放入80℃水浴箱內(nèi)20分鐘，以除去土壤中的雜菌；取出培養(yǎng)管并放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)24～48小時。

1.2.2 分離培養(yǎng)取出庖肉培養(yǎng)基，可見培養(yǎng)管變渾濁，管底肉渣可能部分被消化或變色，產(chǎn)生氣體，有腐敗惡臭味。選用肉湯輕度渾濁，肉渣部分消化呈微黑色，并產(chǎn)生少量氣體，有腐敗惡臭味的培養(yǎng)管內(nèi)的培養(yǎng)物分離破傷風芽胞梭菌；選用肉湯渾濁，肉渣未被消化，但變?yōu)榉奂t色，產(chǎn)生大量氣體，將培養(yǎng)管上層的石蠟沖開的培養(yǎng)管內(nèi)的培養(yǎng)物分離產(chǎn)氣莢膜梭菌；選用肉湯渾濁，肉渣消化變黑色，產(chǎn)生氣體，有腐敗惡臭味的培養(yǎng)管內(nèi)的培養(yǎng)物分離肉毒梭菌。將以上培養(yǎng)物分別分離劃線接種于血平板培養(yǎng)基和普通平板培養(yǎng)基上，于平皿蓋外部中央放2層紗布，中間包夾1g焦性沒食子酸，加10%氫氧化鈉溶液1ml于紗布上，迅速將接種好的平板培養(yǎng)基反轉扣在紗布上（紗布直徑應小于培養(yǎng)基，且不能與培養(yǎng)基表面接觸），并用熔化的石蠟封固外周，放37℃培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)24～48小時，或直接把接種后的平板培養(yǎng)基直接放入37℃厭氧培養(yǎng)箱或厭氧罐中培養(yǎng)。

1.2.3 菌種鑒定（1）破傷風芽胞梭菌的鑒定。破傷風芽胞梭菌在普通培養(yǎng)基上，形成不規(guī)則的圓形，中心實周邊松似羽毛細絲，邊緣呈鋸齒狀的扁平菌落（在血平板上易呈遷徙狀生長，不易獲得單個菌落，應提高瓊脂的濃度）。涂片革蘭氏染色，油鏡觀察可見革蘭陽性細長桿菌，一般為（2～3）μm×（0.3～0.5）μm，芽胞位于菌體的一端，圓形，大于菌體，似鼓槌狀。生化反應不分解糖類，能液化明膠，產(chǎn)生硫化氫，大多數(shù)菌株吲哚實驗陽性[1]。（2）產(chǎn)氣莢膜梭菌的鑒定。產(chǎn)氣莢膜梭菌在血平板上形成2～4mm、圓形、凸起、表面光滑、灰白色、不透明、邊緣整齊的菌落，大多數(shù)菌株的菌落近周有完全溶血環(huán)，其外又有較寬的不完全溶血環(huán)，形成雙層溶血。取典型菌落做革蘭染色油鏡觀察，可見兩端鈍圓，大小為（1～1.5）μm×（3～5）μm的革蘭陽性粗大桿菌，單個或成雙存在，可見橢圓形芽胞形位于菌體中央或次極端，直徑小于菌體的寬度。生化反應，本菌能分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖和蔗糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不分解甘露醇，做洶涌發(fā)酵實驗6小時出現(xiàn)明顯的陽性反應[2]。（3）肉毒梭菌的鑒定。肉毒梭菌在血平板培養(yǎng)24小時，可形成2～4mm白色粗糙的有透明溶血環(huán)的菌落，取典型菌落進行革蘭染色油鏡觀察，可見革蘭陽性粗短桿菌，兩端鈍圓，大小為（1～1.2）μm×（4～6）μm，單獨或成雙排列，有時可成短鏈狀排列。芽胞呈橢圓形，位于菌體次極端，寬于菌體，使菌體呈湯匙狀或網(wǎng)球拍狀。生化反應，本菌分解葡萄糖和麥芽糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不發(fā)酵乳糖，液化明膠，產(chǎn)生H2S，但不產(chǎn)生吲哚[2]。

1.2.4 純培養(yǎng)及菌種保存分別將鑒定后的菌種轉種于另一血平板培養(yǎng)基，用上述方法置37℃厭氧培養(yǎng)24～48小時，再分別轉種庖肉培養(yǎng)基各2支，放入37℃培養(yǎng)箱18小時，取出做菌種，放4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 芽胞標本片的制備（1）破傷風梭菌芽胞標本片的制備。將破傷風梭菌接種于庖肉培養(yǎng)基中，放37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48小時；取出觀察培養(yǎng)管變輕度渾濁，用無菌毛細吸管滴加菌液1滴于潔凈玻片上，用接種環(huán)涂勻，干燥固定；用片夾夾住玻片的一端，滴加石炭酸復紅液（抗酸染色第一液）3滴左右，蓋滿涂膜，并以弱火微加熱使染液出現(xiàn)微汽即可，且勿煮沸燒干，染液將干時，應隨時添加，持續(xù)染色3～5分鐘，待標本片冷卻后水沖洗；加95%酒精脫色2分鐘，水沖洗；加堿性美蘭液（抗酸染色第三液）復染1分鐘，水沖洗；吸水后油鏡觀察，可見破傷風梭菌菌體被染成藍色，芽胞被染成紅色，圓形，位于菌體的極端，膨大，似鼓槌狀。用此法大批制片，染色后加蓋片用中性樹膠封固，晾干后貼標簽長期保存使用。（2）產(chǎn)氣莢膜梭菌芽胞標本片的制備。將產(chǎn)氣莢膜梭菌接種于不含糖的庖肉培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)箱24小時；取出觀察培養(yǎng)管變渾濁，涂片芽胞染色（同破傷風芽胞梭菌芽胞染色）；油鏡觀察，可見產(chǎn)氣莢膜梭菌芽胞被染成紅色，卵圓形，位于菌體的中央或次極端，不膨大，菌體染成藍色。用此法大批制片，長期保存使用。（3）肉毒梭菌芽胞標本片的制備。將肉毒梭菌接種于庖肉培養(yǎng)基中，放37℃培養(yǎng)箱24小時；取出觀察培養(yǎng)管變渾濁，涂片芽胞染色（同破傷風芽胞梭菌的芽胞染色）；油鏡觀察，可見肉毒梭菌菌體被染成藍色，芽胞被染成紅色，卵圓形，位于菌體的次極端，膨大，似網(wǎng)球拍狀。用此法大批制片，長期保存使用。

1.2.6 莢膜標本片制備將產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)18小時的液體培養(yǎng)物0.5ml注射入小白鼠腹腔，10分鐘后殺死小白鼠，置37℃溫箱4～6小時，由于產(chǎn)氣莢膜桿菌產(chǎn)生大量氣體，可使小白鼠體內(nèi)充滿氣體，腹部膨脹，剖檢可見各臟器腫脹，并有許多氣泡，尤以肝臟為甚。剖開肝臟進行涂片，干燥固定；用石炭酸復紅液染色1分鐘，并用微火稍微加熱，待標本放涼后水沖洗；加特殊媒染劑（升汞飽和液2份、20%鞣酸液2份、鉀明礬飽和液1份混合而成）作用0.5分鐘，水沖洗；最后用堿性美蘭液染色1分鐘，水沖洗；吸水后油鏡觀察，結果為菌體被染成鮮明紅色，莢膜呈藍色，位于菌體外周。亦可將涂片直接用革蘭氏染色法進行染色，結果菌體呈紫色，莢膜呈透明圈，位于菌體外周。用此法大批制片，染色后加蓋片用中性膠封固，晾干后貼標簽，放入標本盒內(nèi)長期保存使用。

2 結果

從土壤中分離出的厭氧芽孢梭菌制備的菌種及芽胞和莢膜標本片均非常典型。菌種用于臨床檢驗專業(yè)的厭氧芽胞梭菌培養(yǎng)實驗和洶涌發(fā)酵實驗，芽胞和莢膜標本片用于臨床醫(yī)學專業(yè)及其他醫(yī)學類各專業(yè)的細菌特殊結構觀察實驗，取得了非常好的實驗教學效果。

3 討論

近幾年來厭氧芽孢梭菌引起的感染及食物中毒病例明顯增多，細菌的耐藥性也在不斷增高，這給臨床醫(yī)生治療帶來了很大困難，應引起高度重視。在實驗教學中，臨床標本來源有限，但從土壤中分離厭氧芽孢梭菌比較方便，操作簡單，制備的標本片形態(tài)典型，可廣泛應用于病原生物學實驗教學。

[1]陳興保.病原生物學和免疫學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2007.

[2]劉榮臻.微生物學檢驗[M].北京：高等教育出版社，2007.

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1671-1246（2011）03-0096-02