魯?shù)芦\ 劉偉 姬曉青 劉姝梅

聊城市人民醫(yī)院呼吸科，*中心實驗室，山東 聊城 252000

肺癌是全世界范圍內(nèi)首位腫瘤死因。由啟動子異常甲基化造成的特定基因的沉默在肺癌發(fā)病機制中起重要作用。鈣黏附素(cadherin)是調(diào)整上皮表型和腫瘤侵襲力的細胞黏附分子［1］。CDH13是cadherin家族的成員之一，是一個候選抑癌基因，在人類多種腫瘤中因啟動子甲基化而沉默。在前列腺癌［2］、睪丸生殖細胞腫瘤［3］等的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者支氣管灌洗液中的研究表明，CDH13腫瘤特異性甲基化可能是NSCLC的一個早期診斷有價值的標記［4］。鮮有肺癌患者血清中 CDH13甲基化的研究。甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylation-specific polymerase chain reaction，MSP)是一種應(yīng)用最廣泛的測定甲基化水平的方法。MSP只需要少量的DNA，可檢測出給定的CpG島0.1%的等位基因甲基化［5］。本研究采用MSP法檢測NSCLC患者外周血清中CDH13基因的甲基化狀態(tài)，分析其與臨床病理之間的相關(guān)性，探討其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 研究對象

2007年9月5日—2008年12月20日本院呼吸內(nèi)科住院治療的62例NSCLC患者為研究對象，其中男性40例，女性22例；年齡42～75歲，中位年齡62歲。所有患者均經(jīng)組織病理學證實，其中鱗癌27例，腺癌35例，均未行放化療。TNM分期［6］：Ⅰ期1例，Ⅱ期10例，Ⅲ期24例，Ⅳ期27例。肺部良性疾病患者系我院呼吸內(nèi)科同期住院治療的30例患者，男性18例，女性12例；年齡45～74歲，中位年齡59歲；其中肺部感染8例，慢性阻塞性肺疾病15例，氣胸7例。16名健康志愿者為我院體檢中心體檢者。男性10例，女性6例；年齡46～68歲，中位年齡59歲。3組性別(χ2=0.18，P>0.05)和年齡(方差分析，F(xiàn)=1.05，P>0.05)間差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 標本采集

所有患者均于確診后、手術(shù)或放化療前凌晨空腹采集外周靜脈血5 mL，健康體檢者血液標本由我院體檢中心提供。標本4 ℃靜置2 h，3 000 r/min離心10 min(離心半徑10 cm)，留取血清，將血清標本置-80 ℃保存。

1.2.2 血清DNA提取

采用QIAamp Blood Mini Kit DNA抽提試劑盒(QIAGEN公司，德國)提取血清DNA。每份標本使用2 mL血清，按照說明成比例地增大所需的反應(yīng)試劑用量，多次過離心柱，最后以50μL滅菌去離子水洗脫DNA，-80 ℃保存。

1.2.3 亞硫酸氫鈉修飾

參照Zinn等［7］的方法，對所提取的血清DNA進行亞硫酸氫鈉修飾，將DNA序列中未甲基化的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?U)。

1.2.4 DNA純化及脫磺基反應(yīng)

在提取所得的DNA中，加入1 μg鮭魚精DNA(Sigma公司產(chǎn)品)作為載體，以終濃度為0.3 mol/L的NaOH于40 ℃反應(yīng)15 min變性解鏈，依次加入新鮮配制的對苯二酚(Sigma公司產(chǎn)品)30 μL和pH為5.0的NaHSO3(Sigma公司產(chǎn)品)520 μL，輕柔混勻，以石蠟油覆蓋，55 ℃避光反應(yīng)14 h。吸除石蠟油，采用美國 Promega公司生產(chǎn)的Wizard DNA Clean-Up System 提純DNA，以終濃度為0.3 mol/L的NaOH于室溫處理10 min脫硫，最后冷乙醇沉淀，所得DNA 溶于30μL滅菌去離子水中，-80 ℃保存。

1.2.5 甲基化特異性PCR

參照文獻［8］設(shè)計CDH13引物，分別識別甲基化特異性(M)和非甲基化特異性序列(U)。CDH13具體序列，M正義引物：5’-TCGCGGGGTTCGTTTTTCGC-3’，M反義引物：5’-GACGTTTTCATTCATACACGCG-3’；擴增產(chǎn)物大?。?43 bp。U正義引物：5’-TTGTGGGGTTGTTTTTTGT-3’，U反義引物：5’-AACTTTTCATTCATACACACA-3’；擴增產(chǎn)物大?。?43 bp。

PCR反應(yīng)體系20 μL，其中去離子水14.95 μL，10×PCR緩沖液2 μL，MgCl2(25 mmol/L)1.2 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.25 μL，上下游引物各0.2 μL(25 pmol)，修飾后的DNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶(10 U/μL)0.2μL，充分混勻后置DNA擴增儀中擴增。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、64 ℃(甲基化)、56 °C(非甲基化)退火30 s、72 ℃延伸30 s，共44個循環(huán)，最后72 ℃終延伸5 min［9］。

取擴增產(chǎn)物5 μL行2%的瓊脂糖凝膠電泳(10 V/CM，20 min)，溴化乙啶染色后凝膠成像系統(tǒng)拍照。以正常人外周血淋巴細胞DNA作為非甲基化陽性對照，過量CpG(Sss Ⅰ)甲基化酶(美國NEB公司產(chǎn)品)修飾的淋巴細胞DNA作為甲基化陽性對照，水空白代替DNA作為陰性對照。

1.3 統(tǒng)計學處理

定量資料采用t檢驗，分類資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計學分析在SPSS 12.0版軟件包上完成。

2 結(jié) 果

2.1 血清CDH13基因啟動子區(qū)甲基化檢測結(jié)果

62例NSCLC患者中，有23例患者血清DNA CDH13基因甲基啟動子區(qū)域CpG島發(fā)生了甲基化，檢出率為37.1%，而良性肺部疾病患者和健康體檢者血清未檢出CDH13基因甲基化，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=14.84，P<0.01，圖1)。

2.2 CDH13基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與臨床病理的相關(guān)性

NSCLC患者血清CDH13基因甲基化狀態(tài)與性別、年齡、病理類型和吸煙狀況無明顯相關(guān)(P>0.05)。CDH13甲基化率在TNM Ⅲ～Ⅳ期(43.14%，22/51)高于Ⅰ～Ⅱ期(9.10%，1/11)，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.14，P>0.05)，低、未分化組顯著高于高、中分化組(χ2=4.72，P<0.05，表1)。

圖1 NSCLC患者血清CDH13基因甲基化檢測電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of CDH13 gene methylation in serum of NSCLC patients

3 討 論

DNA甲基化是基因修飾的重要方式，真核生物DNA的甲基化位點主要是CpG島中的胞嘧啶(C)。在腫瘤中，盡管全局上呈現(xiàn)低甲基化，但是在CpG島區(qū)域基因組是高甲基化的，且常常與啟動子相關(guān)。CpG島區(qū)域啟動子甲基化是腫瘤相關(guān)抑癌基因的一種主要的失活機制［10］，與一些腫瘤的演變直接相關(guān)。

Cadherin家族是一組鈣依賴性糖蛋白，廣泛分布于各種類型的細胞表面，和腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。CDH13是cadherin家族中的一個非典型成員，缺少跨膜區(qū)域，通過甘油磷酸肌醇位點錨定于細胞膜的外表面，主要利用其信號蛋白影響分子行為，在腫瘤細胞中表達常常下調(diào)。CDH13基因位于人染色體16q24.2-3，在肺癌和乳腺癌中，其異常甲基化伴隨基因表達缺失［11］。在諸如肺癌、卵巢癌、宮頸癌和前列腺癌等不同腫瘤中CDH13表達下調(diào)與不良預(yù)后有關(guān)。CDH13在大多數(shù)腫瘤細胞株中重新表達可抑制腫瘤細胞增殖和侵襲力，增加對凋亡的易感性，在體內(nèi)減慢腫瘤生長［12］。CDH13表達缺失在NSCLC中經(jīng)常出現(xiàn)，有助于腫瘤的局部生長和種植［13］。CDH13在不同腫瘤中常常因啟動子甲基化而失活，啟動子區(qū)域CpG島的甲基化是導(dǎo)致 CDH13基因失活的主要機制。

表1 CDH13基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between promoter methylation status of CDH13 and clinicopathologic features

研究表明，腫瘤患者外周血中存在一定數(shù)量的DNA，并且含量遠高于正常人，可能來源于腫瘤細胞壞死釋放［14］。從外周血中提取并且作為腫瘤DNA的代表，在腫瘤相關(guān)的分子生物學研究方面開啟了一個新的領(lǐng)域。血清易于取得，因此是理想的DNA 甲基化檢測標本。MSP法是一項應(yīng)用最廣泛的檢測甲基化水平的技術(shù)，常規(guī)MSP的靈敏度可達1∶2 000。本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者血清中CDH13基因甲基化檢出率為37.1%，提示CDH13基因甲基化在NSCLC患者血清中經(jīng)常出現(xiàn)，CDH13基因甲基化及隨之而來的CDH13表達缺失是NSCLC的常見事件。由于在肺部良性疾病患者和健康體檢者外周血血清中未檢測到CDH13基因啟動子甲基化，因此，NSCLC患者外周血清中CDH13基因啟動子甲基化具有腫瘤特異性。CDH13甲基化作為一個新的NSCLC腫瘤標記，有望成為啟動子甲基化框架內(nèi)有價值的篩選NSCLC的標志。

既往利用NSCLC切除標本檢測CDH13甲基化狀況的研究報道，腫瘤組織中CDH13甲基化率為29.5%～66%［1,15］，均高于本研究結(jié)果，可能與組織中DNA數(shù)量大于血液有關(guān)。Ulivi等［16］檢測NSCLC患者血清中CDH13基因甲基化率為23%，低于本研究結(jié)果，可能與病例選擇和(或)種族差異有關(guān)。Hsu等［17］研究顯示，肺癌組織與相應(yīng)血清DNA中CDH13基因甲基化檢測結(jié)果是一致的。Rykova等［18］認為，血清中CDH13甲基化檢測可以用于肺癌的早期診斷。采用外周血提取DNA研究目標基因的甲基化狀況，方法基本無創(chuàng)，簡單易行，患者易于接受，如果能得到進一步證實，那么外周血中基因甲基化的檢測有望成為肺癌早期診斷的重要輔助手段。

本研究進一步比較了NSCLC患者血清CDH13基因甲基化檢出率與臨床特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清CDH13基因甲基化狀況與患者性別、年齡、病理類型和吸煙狀況無關(guān)，低、未分化組檢出率顯著高于高、中分化組，提示CDH13基因甲基化可能與NSCLC惡性程度有關(guān)。肺癌惡性程度高，侵襲力強，易于復(fù)發(fā)，患者生存期短。Kubo等［19］研究100例支氣管肺泡癌標本發(fā)現(xiàn)，CDH13 在侵襲性類型的甲基化率明顯高于非侵襲性類型。Brock等［20］發(fā)現(xiàn)，Ⅰ期NSCLC外科手術(shù)切除患者CDH13啟動子區(qū)域的甲基化和早期復(fù)發(fā)有關(guān)。Yanagawa等［21］用MSP法檢測101例NSCLC腫瘤切除組織CDH13啟動子甲基化狀況，和CDH13甲基化陰性組相比，陽性組患者生存期更短。癌細胞粘附力的降低是肺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制之一。啟動子甲基化造成的CDH13表達下降，導(dǎo)致維持細胞間同質(zhì)型粘附的黏附分子表達下降，可能是NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移的重要原因之一。Feng等［22］認為，檢測CDH13在血液中的甲基化狀況可能用于NSCLC患者早期術(shù)后復(fù)發(fā)的監(jiān)測。雖然患者CDH13基因甲基化率在Ⅲ～Ⅳ期明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，但尚無統(tǒng)計學意義，與Ulivi等［16］在肺癌組織和相應(yīng)血清中的研究結(jié)論相似。提示CDH13基因甲基化可能在NSCLC早期即已發(fā)生，在病情加重過程中持續(xù)存在并逐漸進展。Kim等［23］研究305例NSCLC石蠟標本CDH13甲基化狀況，其甲基化率為43%，并且與病理分期有關(guān)，病理分期越晚，陽性率越高。因此，CDH13甲基化可能和NSCLC進展有關(guān)。眾所周知，吸煙是肺癌的危險因素之一，也與DNA甲基化有關(guān)［24］。本研究中，CDH13甲基化組和非甲基化組吸煙指數(shù)無差異，尚無明確的解釋，可能與病例選擇有關(guān)，也可能系除吸煙以外的致癌因素誘導(dǎo)了分子變化而致。

總之，NSCLC患者外周血中CDH13基因的甲基化檢出率較高。CDH13基因異常甲基化可能在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，有望成為NSCLC輔助診斷分子標記，CDH13也許能成為NSCLC的一個可能的治療靶點。有必要進行進一步的研究評估。

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