熊正文 張華東 胡海霞 黃勇 李宏偉 尋鳳華

中國人民解放軍二五一醫(yī)院病理科(北京軍區(qū)腫瘤病理技術(shù)研究診療中心)，河北 張家口 075000

宮頸鱗癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死亡率呈逐年上升趨勢［1］。近年研究表明，轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail［2-4］和熱休克蛋白70(heat shock proteins 70，HSP70)［5-7］與人體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移等關(guān)系十分密切。本研究應(yīng)用原位雜交(in situ hybridization，ISH)技術(shù)檢測了Snail mRNA及HSP70 mRNA在宮頸良、惡性病變中的表達(dá)及其與宮頸癌生物學(xué)病理特征的關(guān)系，旨在分子水平探討兩者的表達(dá)與宮頸癌生物學(xué)特征的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集本科2008—2010年間宮頸組織標(biāo)本蠟塊共120例，其中慢性宮頸炎15例，宮頸上皮內(nèi)瘤樣變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)35例，宮頸癌70例，均經(jīng)病理確診，未進(jìn)行術(shù)前放化療；宮頸癌患者年齡26～87歲，中位年齡48歲，其中36例≤48歲，34例> 48歲；70例宮頸癌標(biāo)本中，高分化19例，中分化44例，低分化7例。根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，70例宮頸癌標(biāo)本中，Ⅰ期17例，Ⅱ期43例，Ⅲ期10例。浸潤癌浸潤深度為：＜1/3者51例，≥1/3者19例，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者24例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者46例。

1.2 試劑及其來源

Snail、HSP70原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，探針為針對人Snail靶基因的mRNA序列：5’-AGAGTTTACC TTCCAGCAGCCCTACGACCAGGCCC-3’；5’-AAGGCCTTCAACTGCAAATACTGCAACAAG GAATA-3’；5’-TACCAGTGCCAGGCGTGTG CTCGGACCTTCTCCCG-3’。HSP70靶基因的mRNA探針序列為：5’-CCTGGCAGCCCTT TCTCAAGGACCACCGCA-3’；5’-AAGCATTCG TCCGGTTGCGCTTTCCTTTCT-3’；5’-AG AAAGTGCGCCGTGCCATCGAGCAGCTGG-3’。顯示系統(tǒng)為生物素化鼠抗地高辛和過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素(SABC-POD)，DAB顯色。

1.3 原位雜交

石蠟切片復(fù)溫，脫蠟至水。3%H2O2室溫作用10 min，蒸餾水洗3次，3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶室溫消化30 min。1%多聚甲醛室溫固定10 min，蒸餾水洗3次，按每張切片滴加20 μL預(yù)雜交液，濕盒放入40 ℃恒溫箱中4 h。滴加雜交液每片20 μL，38～42 ℃恒溫箱中過夜。37 ℃預(yù)溫的2×SSC沖洗5 min×3次，37 ℃預(yù)溫的0.5×SSC沖洗5 min×3次，37 ℃預(yù)溫的0.2×SSC沖洗5 min×3次。滴加封閉液，37 ℃30 min。滴加生物素化鼠抗地高辛，37 ℃60 min。滴加SABC，37 ℃ 20 min。滴加生物素過氧化物酶，37 ℃ 20 min。DAB避光顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片，每批染色均用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS代替雜交液作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷

Snail、HSP70原位分子雜交陽性信號為棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞質(zhì)。每例切片選擇10個高倍視野，按陽性細(xì)胞數(shù)占視野中總細(xì)胞數(shù)的百分比分為陽性與陰性，無陽性著色或陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性，陽性細(xì)胞數(shù)≥10%為陽性［8］。HSP70 mRNA原位分子雜交陽性信號為棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞質(zhì)，每例切片選擇10個高倍視野，由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生以盲審法確定陽性率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，運(yùn)用χ2檢驗(yàn)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Snail及HSP70 mRNA在宮頸病變中的表達(dá)

Snail mRNA、HSP70 mRNA、原位分子雜交陽性信號在慢性宮頸炎組織、宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變和宮頸鱗狀細(xì)胞癌中均有不同程度的表達(dá)，呈棕黃色，陽性表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞質(zhì)，呈明顯的棕黃色彌漫性顆粒狀表達(dá)。70例宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中，Snail mRNA陽性率為80.0%(56/70)，分別高于宮頸鱗狀上皮瘤變組織60.0%(21/35)和宮頸慢性炎癥20.0%(3/15)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.773，P<0.05和χ2=18.215，P<0.05，圖1、表1)；HSP70 mRNA宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中陽性率為85.7%(60/70)，分別高于宮頸鱗狀上皮瘤變組織45.7%(16/35)和宮頸慢性炎癥26.7%(4/15)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.728，P<0.01和χ2=20.088，P<0.01，圖2、表1)。

2.2 Snail mRNA及HSP70 mRNA的表達(dá)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系

Snail mRNA在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于無轉(zhuǎn)移組(P<0.05)；而在不同年齡、FIGO分期、病理分級及浸潤深度情況之間，Snail mRNA、HSP70 mRNA無明顯變化(P均>0.05，表2)。

2.3 宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中Snail及HSP70 mRNA表達(dá)的關(guān)系

圖1 Snail mRNA在慢性宮頸炎(A)、CINⅡ級(B)和中分化鱗狀細(xì)胞癌(C)組織中陽性表達(dá)Fig.1 Snail mRNA positive expression in chronic cervicitis (A), CINⅡ grade (B) and in moderately differentiation cervical squamous cancer (C)(ISH, ×200)

圖2 HSP70 mRNA在慢性宮頸炎(A)、CINⅡ級(B)和中分化鱗狀細(xì)胞癌(C)組織中陽性表達(dá)Fig.2 HSP70 mRNA positive expression in chronic cervicitis (A), CINⅡ grade (B) and in moderately differentiation cervical squamous cancer (C)(ISH, ×200)

表1 Snail及HSP70 mRNA在宮頸各類型組織中的表達(dá)情況Tab.1 The expression of Snail mRNA and HSP70 mRNA in various cervical tissues

表2 Snail mRNA及HSP mRNA表達(dá)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 Correlation of Snail mRNA and HSP70 mRNA expression with clinic pathological features in cervical squamous cancer

經(jīng)Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)分析顯示，隨著HSP70 mRNA陽性表達(dá)增強(qiáng)，Snail mRNA的陽性表達(dá)明顯增高，兩者在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.306，P<0.05，表3)。

表3 宮頸鱗狀細(xì)胞癌中Snail mRNA和HSP mRNA表達(dá)的相關(guān)性Tab.3 Relationship between expression of Snail mRNA and HSP70 mRNA in cervical squamous cancer

3 討 論

Snail首先發(fā)現(xiàn)于果蠅中，是一類鋅指轉(zhuǎn)錄因子，因在許多惡性腫瘤中呈高表達(dá)而備受關(guān)注。Snail屬于鋅指蛋白Snail超家族，通過與Smad相互作用蛋白(Smad-interacting protein-1，SIP1)競爭性結(jié)合E-cadherin啟動子區(qū)的E-box序列，抑制E-cadherin、occludin等的表達(dá)，上調(diào)FSP1、vimentin和Rho等的表達(dá)，從而誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的發(fā)生，提高細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，所以Snail可以被看作腫瘤轉(zhuǎn)移的促進(jìn)因素［9-10］，其高表達(dá)于乳腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌和食管癌等，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級密切相關(guān)［11-12］。本研究發(fā)現(xiàn)Snail mRNA在宮頸慢性炎癥、宮頸鱗狀上皮瘤變和宮頸鱗狀細(xì)胞癌陽性率分別是20%(3/15)、60%(21/35)和80%(56/70)，從慢性炎癥、癌前病變到惡性病變，Snail表達(dá)呈逐漸增高的趨勢，而差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示Snail基因與宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生有密切關(guān)系。Snail mRNA在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率為95.8%，明顯高于無轉(zhuǎn)移組71.7%(P<0.05)，而在不同年齡、FIGO分期、病理分級及浸潤深度情況之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果提示宮頸鱗癌中Snail mRNA表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。

熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生一組高度保守的蛋白質(zhì)［13］，由真核細(xì)胞產(chǎn)生，參與多種蛋白的折疊、裝配及轉(zhuǎn)運(yùn)等蛋白質(zhì)加工修飾過程，具有“分子伴侶(molecular chaperone)的”作用［14-15］。HSPs在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、DNA損傷修復(fù)、基因產(chǎn)物代謝等過程中起重要作用。HSP又稱應(yīng)激蛋白，在正常細(xì)胞中表達(dá)很低，在高熱、乙醇中毒、病毒感染、氨基酸類似物儲積、DNA損傷、缺氧、重金屬離子過多、細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)變性自身蛋白等應(yīng)激因素影響下，細(xì)胞內(nèi)HSPs表達(dá)增強(qiáng)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，使細(xì)胞耐受應(yīng)激損傷，這是細(xì)胞的一種自身保護(hù)［16］。HSPs按其相對分子質(zhì)量大小分為若干家族，在眾多的HSPs中，以HSP60、HSP70在大多數(shù)生物細(xì)胞中含量最多［17］。近年來的研究側(cè)重于HSP70蛋白與腫瘤的關(guān)系，但從分子水平探討HSP70 mRNA與腫瘤關(guān)系的報道少見。因此，我們應(yīng)用高靈敏度的核酸原位雜交的技術(shù)探討了HSP70 mRNA表達(dá)在宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：HSP70 mRNA在宮頸慢性炎癥、宮頸鱗狀上皮瘤變和宮頸鱗狀細(xì)胞癌陽性率分別是26.7%(4/15)、45.7%(16/35)和85.7%(60/70)，從良性、癌前病變到惡性病變呈逐漸增高的趨勢，而差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果提示HSP70與宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生有著十分密切關(guān)系。研究還發(fā)現(xiàn)HSP70 mRNA在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率為91.7%，高于無轉(zhuǎn)移組的82.6%，而在不同年齡、FIGO分期、病理分級及浸潤深度情況之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果提示宮頸鱗癌中HSP70 mRNA表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性，可能與標(biāo)本量過少有關(guān)。HSP70的高表達(dá)一方面介導(dǎo)癌基因及抑癌基因產(chǎn)物的構(gòu)象成熟、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，另一方面介導(dǎo)錯配蛋白的降解，協(xié)調(diào)腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)代謝平衡，使腫瘤細(xì)胞無限增殖。

HSPs與細(xì)胞轉(zhuǎn)化和惡變過程密切相關(guān)［18］。腫瘤組織中的HSPs可抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，容易誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡，還與腫瘤多藥耐藥的形成有關(guān)［19］。本組70例宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中，Snail mRNA和HSP mRNA表達(dá)在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)正相關(guān)(r=0.306，P<0.05)。Snail和HSP70表達(dá)與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)，因此，聯(lián)合檢測Snail mRNA和HSP70 mRNA的表達(dá)對判斷宮頸鱗狀細(xì)胞癌的惡性程度、預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有重要意義。

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