干文娟 馮一中 李峰

1.蘇州大學附屬第一醫(yī)院病理科，江蘇 蘇州 215006；2.蘇州大學醫(yī)學部病理學系，江蘇 蘇州 215123；3.蘇州大學附屬第二醫(yī)院病理科，江蘇 蘇州 215004

缺氧是實體腫瘤生長過程中普遍存在的一種現(xiàn)象，腫瘤細胞的侵襲性和遠處轉移性與缺氧有關，介導缺氧反應的主要調節(jié)者是缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)，HIF-1由HIF-1α和HIF-1β兩個亞基組成。其中HIF－1a是HIF-1的活性亞基，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展和預后預測中具有重要意義，目前對于HIF-1α在胰腺癌中表達情況的研究國內外還鮮見報道。熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是生物體中普遍存在的高度保守的蛋白質，其主要的生物學功能是在應激狀態(tài)下與靶蛋白形成復合體，以調節(jié)靶蛋白的活性和功能，但又不參與靶蛋白的組成。因此，HSP又被稱為“分子伴侶”或“伴侶蛋白”。HSP90是分子伴侶中一組較為獨特的蛋白質，除了作為分子伴侶參與蛋白質的折疊、運輸和合成過程以外，還能和一系列參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的信號轉導系統(tǒng)中的激酶分子和突變蛋白質相結合，并調節(jié)它們的穩(wěn)定性，從而影響多種信號轉導途徑。

HSP90在胰腺癌中的過表達可能參與了胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移［1］。本研究利用組織芯片技術結合免疫組化方法檢測胰腺癌組織中HIF-1α、HSP90蛋白的表達及其與胰腺癌臨床病理參數(shù)之間的關系，探討HIF-1α、HSP90在胰腺癌發(fā)生過程中的作用及對預后的影響。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集本校附屬醫(yī)院及部分外院1993年—2007年胰腺癌手術標本和臨床資料齊備者88例，所有患者均未給予術前放療、化療，且腫瘤組織均制備組織切片并行HE染色，并由2名病理醫(yī)師采用雙盲法確診為胰腺導管腺癌，其中位于胰頭者64例，胰體尾部者24例；男性59例，女性29例，年齡39～80歲，中位年齡62.50歲；腫瘤直徑≤4 cm者45例，>4 cm者43例；按照1997年國際抗癌協(xié)會(UICC)制定的TNM臨床分期標準進：Ⅰ期29例，Ⅱ期11例，Ⅲ期27例，Ⅳ期21例。組織學分級為：高分化腺癌17例，中分化腺癌50例，低分化腺癌21例；伴有淋巴結轉移者39例，無淋巴結轉移者49例。88例患者中有53例獲得隨訪資料，隨訪時間為2個月～6年，平均隨訪時間為(13.32±10.35)個月。其中死亡數(shù)為48例，生存(截尾數(shù)據) 數(shù)為5例。另外選取11例同時期非腫瘤性胰腺組織手術標本作為對照。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片的制作

標本均為4%甲醛溶液固定，常規(guī)組織處理、石蠟包埋。采用手工制作組織芯片，所用組織芯片制作儀為Instrumendics公司產品，取樣針直徑1.5 mm，組織芯間距1.0 mm。組織芯片制作步驟見文獻［2］。

1.2.2 免疫組織化學檢測

對HIF-1α、HSP90分別采用SABC法、EnVision染色法，染色步驟按產品說明書進行，DAB顯色，一抗HIF-1α多克隆抗體(BA-0912)及二抗生物素化羊抗兔IgG抗體均購自Santa Cruz公司，HIF-1α抗體的工作濃度為1∶50，羊抗兔IgG抗體為即用型抗體。HSP90α/β(N-17)多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，工作濃度為1∶100，即用型EnVision試劑(HRP/Rabbit)購于丹麥Dako公司。用PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性的胰腺癌切片作為陽性對照。

1.2.3 免疫組織化學陽性結果判定

用雙盲法由2位有經驗的病理醫(yī)師分別對免疫組化染色結果進行評估。鏡檢顯示胞質或胞核染為淡黃色至棕黃色為陽性細胞標志。HIF-1α蛋白的陽性染色主要定位于細胞質，少數(shù)定位于細胞核，HSP90在細胞的胞質及胞核均有表達，以胞核表達為主。在高倍鏡(×400)下對每張切片隨機選擇5個視野，每個視野計數(shù)200個細胞，共計1 000個。參照Gustavo等［3］的方法，綜合染色強度和陽性細胞占總細胞數(shù)的百分比進行半定量處理；根據染色強度的評分標準為：沒有染色為0分；弱染色但強于陰性對照為1分；中度染色為2分；強染色為3分；根據陽性細胞數(shù)的評分標準為：無陽性細胞數(shù)為0分；不足34%陽性細胞數(shù)為1分；34%～66%陽性細胞數(shù)為2分；>66%陽性細胞數(shù)為3分。上述評分結果兩項相乘，0～6分為低表達，>6分為高表達。

1.3 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計軟件使用SPSS 13.0軟件包。HIF-1α、HSP90蛋白在非腫瘤性胰腺組織及胰腺癌各臨床參數(shù)之間表達差異的比較采用四格表資料的χ2檢驗。用Spearman秩相關進行HIF-1α、HSP90蛋白表達的相關性分析。對有隨訪資料的HIF-1α、HSP90的表達作出Kaplan-Meier生存曲線，各組間生存率用log-rank檢驗進行組間生存率的比較，HIF-1α、HSP90的表達與預后的關系采用單因素Cox回歸模型進行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 組織芯片

成功制備胰腺癌組織芯片蠟塊1個，為11×9點組織列陣，含99個位點，無組織芯脫落(圖1A)。組織芯片切片HE染色顯示所有位點組織結構保存良好，無明顯壞死組織，組織芯片排列整齊(圖1B)。

2.2 HIF-1α與HSP90蛋白表達

2.2.1 HIF-1α蛋白表達

胰腺癌組織中HIF-1α蛋白主要定位于癌細胞胞質和胞核，以胞質著色為主(圖2A)，非腫瘤性胰腺組織均無HIF-1α表達。88例胰腺癌中有67例HIF-1α高表達(76.1%)，而對照組胰腺組織中HIF-1α表達陰性，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=25.910，P<0.001)。HIF-1α高表達與腫瘤大小、TNM分期及淋巴結轉移相關(P<0.01，表1)。

圖1 組織芯片圖Fig.1 Tissue microarray

2.2.2 HSP90蛋白表達

胰腺癌組織中HSP90蛋白主要定位于癌細胞胞質和胞核，以胞核著色為主(圖2B)。本組患者HSP90蛋白在胰腺癌中高表達率為73.9%，在非腫瘤性胰腺組織中高表達率為18.2%，兩組差異有統(tǒng)計學意義(χ2=13.858，P<0.001)。HSP90高表達與腫瘤TNM分期及淋巴結轉移相關(P<0.01)；而與腫瘤大小、部位、病理分級無關(P>0.05，表1)。

2.2.3 HIF-1α、HSP90在胰腺癌中表達的相關性

Spearman秩相關分析顯示，在胰腺癌中，HIF-1α與HSP90表達呈顯著正相關(P<0.01，表2)。

表1 HIF-1α和HSP90的表達與胰腺癌患者臨床病理特征之間的關系Tab.1 The relationship between HIF-1α and HSP90 expression and clinical pathological characteristics of pancreatic carcinoma patients[n(%)]

圖2 HIF-1α和HSP90在胰腺癌中陽性表達Fig.2 Positive expression of HIF-1α and HSP90 in pancreatic carcinoma

表2 胰腺癌中HIF-1α、HSP90的相關性分析Tab.2 Correlation analysis of HIF-1α and HSP90 in the pancreatic carcinoma

2.3 HIF-1α、HSP90表達與胰腺癌患者生存期的關系

對53例獲得隨訪結果的胰腺癌患者進行Kaplan-Meier生存分析，結果顯示HIF-1α低表達組患者的總生存率明顯高于各自高表達組，用log-rank檢驗進行組間生存率檢驗結果顯示，HIF-1α組間生存率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=13.098，P<0.001)，即HIF-1α高表達與胰腺癌預后不良有關，而HSP90的高表達組與低表達組在Kaplan-Meier曲線中有相交點，log-rank檢驗組間生存率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.068，P=0.08，圖3、4)。

經Cox比例風險回歸模型分析，單因素分析顯示，HIF-1α表達可作為評估胰腺癌患者預后的指標(表3)。

圖3 HIF-1α表達與生存期的關系Fig.3 Relationship of HIF-1α expression and life span

圖4 HSP90表達與生存期的關系Fig.4 Relationship of HSP90 expression and life span

表3 胰腺癌單因素生存(COX比例風險模型分析)結果Tab.3 Univariate survival result of pancreatic carcinoma (Cox rate risk model analysis)

3 討 論

缺氧是腫瘤微環(huán)境的基本特征之一，同時腫瘤細胞的缺氧也是腫瘤發(fā)生惡性轉化甚至轉移的啟動因子。HIF-1α是調節(jié)細胞內氧代謝的關鍵因子之一，也是迄今發(fā)現(xiàn)的惟一能在特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性作用的轉錄因子。

HIF-1α在胰腺癌中存在高表達。Kitada等［4］用免疫組織化學的方法對胰腺癌組織進行HIF-1α檢測，結果是29例(59.2%)呈過表達，淋巴結局部轉移的有19例(76.0%)呈過表達，而在非腫瘤的胰腺組織中表達呈陰性，HIF-1α與胰腺癌的腫瘤大小及TNM分期顯著相關。Akakura等［5］也證實20株胰腺癌細胞有15株表達HIF-1α蛋白，而且HIF-1α表達與胰腺癌的擴增和生存有關。本研究結果與上述文獻報道基本一致：88例胰腺癌中67例HIF-1α呈高表達，而11例正常胰腺組織中無表達，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。HIF-1α高表達率與胰腺癌的大小相關(P<0.01)，即表明大多數(shù)胰腺癌組織存在著缺氧，在體積大的腫瘤組織中HIF-1α高表達率高，考慮是與體積大的腫瘤組織生長過快，內部缺氧發(fā)生早，且程度重有關；研究還表明，HIF-1α高表達率與胰腺癌的臨床分期和淋巴結轉移相關(P<0.01)，表明HIF-1α蛋白的表達預示胰腺癌有較高的惡性度和侵襲性。

關于HIF-1α與胰腺癌預后的關系報道中，Shibaji等［6］研究顯示，HIF-1α表達與胰腺癌不良預后呈正相關，其高表達的患者預后較差。Sun等［7］研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α高表達患者的總生存率低，Cox回歸分析顯示，HIF-1α是胰腺癌的預后指標。本研究隨訪分析結果顯示，HIF-1α高表達者預后較差，HIF-1α高表達與低表達生存曲線差別具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，經單因素、多因素Cox比例風險回歸模型分析顯示，HIF-1α表達具有獨立預后意義(P<0.05)，即HIF-1α高表達與胰腺癌不良預后有關，本組實驗結果與文獻報道相一致，由此可見，快速生長的胰腺癌細胞可產生過量的HIF-1α，激活多種靶基因的轉錄，提高能量代謝及血管形成體系，使之適應這一缺氧環(huán)境而繼續(xù)增殖、浸潤和轉移。因此，HIF-1α的表達可反映胰腺癌的生物學行為，可以作為判斷胰腺癌浸潤、轉移和預后的有價值指標。

至今已經發(fā)現(xiàn)HSP90在多數(shù)腫瘤中呈高表達。Ogata等［8］報道胰腺癌中HSP90a呈選擇性高表達，且與腫瘤的致癌作用有關。Kim等［9］研究結果表明，HSP90抑制劑選擇性阻止了胰腺癌細胞的生長和擴增，可見HSP90與胰腺癌有著密切的聯(lián)系。本研究結果顯示：HSP90在胰腺癌組織中的表達水平顯著高于正常胰腺組織(P<0.01)，這一結果與各文獻中報道的HSP90在多種惡性腫瘤中呈高表達的結論一致。HSP90在正常胰腺組織中的表達，認為其作為分子伴侶參與調節(jié)正常胰腺腺泡細胞及導管細胞的生長和增殖；而在胰腺癌中的過表達，可能與胰腺癌細胞的惡性增殖相關，需要大量的HSP90調節(jié)和穩(wěn)定這一異常增殖過程有關。

目前對于HSP90與腫瘤病理參數(shù)及預后的關系報道不一。Pick等［10］研究認為，HSP90與乳腺癌的病理分級、腫瘤大小、淋巴結轉移相關，是乳腺癌獨立的預后指標。而Kurahashi等［11］對172例前列腺標本進行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)HSP90與病理分級、淋巴結轉移、腫瘤大小無關。本研究結果顯示：胰腺癌中臨床分期越晚的HSP90表達越高，有淋巴結轉移組HSP90表達比無淋巴結轉移組高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示HSP90與胰腺癌的侵襲、轉移能力有一定的相關性。本研究結果還顯示：HSP90與胰腺癌的病理分級無關，可能與HSP90表達存在著組織差異性有關；HSP90的表達與胰腺癌患者預后無關，可能與HSP90作為分子伴侶的功能有關，其機制有待進一步論證。

有關HIF-1α和HSP90的關系報道不多，Minet等［12］研究認為在缺氧條件下，HSP90與HIF-1α的bHLH-PAS 結構域結合來激活HIF-1α，而且HSP90的活性對于HIF-1α的激活作用是必須的。Lang等［13］研究結果表明，HSP90抑制劑17-AAG阻止了胰腺癌IL-6/STAT3/HIF-1α自分泌環(huán)，抑制了腫瘤的生長。Jennifer等［14］使用VHL功能缺失的腎癌細胞株RCC進行實驗，發(fā)現(xiàn)了HSP90抑制劑的功能：⑴通過氧非依賴E3泛素連接酶促進了HIF-1α降解。⑵減少了HIF-1α轉錄活性。由此可以推斷，HSP90與HIF-1α的降解和轉錄活性有關。本研究結果顯示，HIF-1α和HSP90聯(lián)合表達與胰腺癌的臨床分期、淋巴結轉移相關。

隨著研究的不斷深入，目前已將HIF-1α、HSP90作為治療各類腫瘤的靶點，如HIF-1α516、格爾德霉素(geldanamycin，GA)等已進入臨床試驗，本研究結果為研發(fā)藥物來干預和治療胰腺癌提供了理論依據。

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