張孝艷 喬玉環(huán) 王琳 郭瑞霞

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450052

宮頸癌是威脅女性健康的第二大婦科惡性腫瘤，并具有年輕化趨勢(shì)?，F(xiàn)已證實(shí)人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是宮頸癌及癌前病變的重要致病因素，大部分感染者可自然消退，僅有少數(shù)感染的婦女最終發(fā)展為宮頸癌［1］，這表明HPV感染并不是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的唯一因素。近年來(lái)，Wnt信號(hào)通路在腫瘤形成過(guò)程中的作用成為研究的熱點(diǎn)。分泌型卷曲相關(guān)蛋白1(secreted frizzled related protein 1，sFRP1)是Wnt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，對(duì)Wnt信號(hào)通路的傳導(dǎo)具有重要的抑制作用。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)作為Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的核心元件參與調(diào)節(jié)該通路。本研究通過(guò)檢測(cè)sFRP1和β-catenin在宮頸癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)及正常宮頸組織中的表達(dá)情況，探討其在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2001年—2005年病理科存檔的宮頸石蠟標(biāo)本128例，其中正常宮頸20例，CIN 30例，宮頸癌78例(均有確切隨訪資料)。宮頸癌組織學(xué)類型：鱗癌60例，腺癌18例；臨床分期(FIGO，2000)：Ⅰ期34例，Ⅱ期31例，Ⅲ～Ⅳ期13例；病理學(xué)分級(jí)：G1～G254例，G324例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者21例。患者中位年齡41歲(25～65歲)，術(shù)前均未接受放化療。所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)。

1.2 試劑和方法

兔抗人sFRP1抗體和兔抗人β-catenin抗體均購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司，免疫組化(SP法)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑及抗原修復(fù)液均由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。用已知的sFRP1和β-catenin陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

1.3.1 sFRP1的判定［2］

sFRP1陽(yáng)性反應(yīng)定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。光學(xué)顯微鏡下選取5個(gè)視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞≤2%記為0分，>2%～<20%為1分，20%～<50%為2分，≥50%為3分。按著色深淺記分，無(wú)著色為0分，淺著色為1分，深著色為2分。上述兩項(xiàng)分值相加為著色強(qiáng)度積分值：<2分為陰性(-)，2～<3分為弱陽(yáng)性(+)，3～<4分為陽(yáng)性(++)，≥4分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.3.2 β-catenin的判定［3］

β-catenin正常染色定位于細(xì)胞膜。光學(xué)顯微鏡下選取5個(gè)視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞<25%記為0分，25%～<50% 為1分，50%～<75% 為2分，≥75%為 3分。按染色強(qiáng)度：無(wú)染色0分，淡黃染色1分，深黃色2分，棕褐色3分。取兩者之和：0分為陰性(-)，1～2分為弱陽(yáng)性(+)，3～4分為陽(yáng)性(++)，5分及5分以上為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。其中>10%細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核出現(xiàn)β-catenin表達(dá)為異位表達(dá)，陰性(-)、弱陽(yáng)性(+)和異位表達(dá)皆為異常表達(dá)，陽(yáng)性(++)、強(qiáng)陽(yáng)性(+++)為正常表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行處理。率的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，生存率采用Kaplan-Meier和logrank分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 sFRP1的表達(dá)及其與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

20例正常宮頸 上皮組織sFRP1染色均呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為100.0%(圖1A)。30例CIN組織中sFRP1陽(yáng)性率為70.0%(21/30)，呈弱表達(dá)(圖1B)。78例宮頸癌組織中sFRP1陽(yáng)性率為33.3%(26/78)，呈微弱表達(dá)(圖1C、D)。3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=33.26，P<0.05)。

宮頸癌組織中臨床Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ～Ⅳ期sFRP1表達(dá)陽(yáng)性率分別為50%、25.8%和7.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.89，P<0.05)，其中Ⅰ期的表達(dá)率明顯高于Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(66.7%vs 28.1%，P<0.05)；sFRP1的表達(dá)與宮頸癌的病理學(xué)分級(jí)和組織學(xué)類型均無(wú)關(guān)(P>0.05，表1)。

2.2 β-catenin的表達(dá)及其與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

正常宮頸上皮β-catenin主要表達(dá)于細(xì)胞膜上，呈棕褐色細(xì)小顆粒狀，僅1例同時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性著色，細(xì)胞核無(wú)著色。在CIN及宮頸癌組織中，β-catenin呈明顯的異常表達(dá)，表現(xiàn)為細(xì)胞膜表達(dá)減弱或消失，細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的著色(圖2)。β-catenin在正常宮頸、CIN及宮頸癌組織中的異常表達(dá)率分別為5%(1/20)、43.3%(13/30)、70.5%(55/78)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=29.56，P<0.05)。

宮頸癌組織中臨床Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ～Ⅳ期β-catenin異常表達(dá)率分別為52.9%、80.6%和92.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.55，P<0.05)，其中Ⅰ期的異常表達(dá)率顯著低于Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期(P<0.05)；β-catenin異常表達(dá)強(qiáng)度在病理學(xué)分級(jí)G1～G2與G3之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；β-catenin異常表達(dá)強(qiáng)度在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；β-catenin異常表達(dá)與宮頸癌的組織學(xué)類型無(wú)關(guān)(P>0.05)。

圖1 sFRP1在各組織中的表達(dá)Fig.1 The expression of sFRP1 in different tissues(SP, ×400)

圖2 β-catenin在各組中的表達(dá)Fig.2 The expression of β-catenin in different tissues(SP, ×400)

表1 sFRP1與β-catenin的表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 The relationship between expressions of sFRP1 and β-catenin and clinicopathological characteristics in cervical cancer

2.3 宮頸癌組織中sFRP1表達(dá)與β-catenin表達(dá)的相關(guān)性

34.6%的sFRP1陽(yáng)性表達(dá)宮頸癌患者中β-catenin呈現(xiàn)異常表達(dá)，而sFRP1陰性表達(dá)的宮頸癌患者中β-catenin的異常表達(dá)率達(dá)88.5%，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。宮頸癌組織中sFRP1陽(yáng)性表達(dá)與β-catenin的異常表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.557，P<0.001)。

2.4 sFRP1、β-catenin表達(dá)與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系

在78例宮頸癌患者中，sFRP1陽(yáng)性表達(dá)26例，陰性表達(dá)52例，sFRP1陽(yáng)性表達(dá)者5年生存率高于陰性表達(dá)者(79.8% vs 60.5%，P<0.05)。β-catenin正常表達(dá)23例，異常表達(dá)55例，正常表達(dá)者5年生存率顯著高于異常表達(dá)者(83.7%vs 59.2%，P<0.05)。

3 討 論

sFRP1在胚胎發(fā)育階段參與眼、腦及血管系統(tǒng)的形成和細(xì)胞分化，在成體中主要表達(dá)于腦脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜、晶狀體、睫狀體及血管內(nèi)皮等組織，參與這些組織的代謝［4］。sFRP1作為W nt信號(hào)上游抑制因子，含有一個(gè)CRD(半胱氨酸富含域)結(jié)構(gòu)域，其部分氨基端序列與Wnt蛋白受體即卷曲蛋白(frizzled，F(xiàn)rz)結(jié)構(gòu)類似，通過(guò)與Frz競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Wnt蛋白或與Frz結(jié)合成無(wú)功能的復(fù)合體發(fā)揮抑制Wnt信號(hào)通路的作用，在抗腫瘤及促細(xì)胞凋亡等生物過(guò)程中起到了一定的作用［5］。Chunga等［6］研究證實(shí)了sFRP1在宮頸癌細(xì)胞中是一種抑癌基因，sFRP1的表觀遺傳學(xué)沉默激活了Wnt經(jīng)典通路的原癌基因，并且通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)使sFRP1重新表達(dá)后，能夠有效抑制宮頸癌CaSki細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲。有研究表明，sFRP1在多種人類實(shí)體腫瘤中存在表達(dá)缺失，如結(jié)直腸癌、乳腺癌及腎細(xì)胞癌等［7-9］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著病變程度的加深，sFRP1的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，在正常宮頸上皮組織、CIN和宮頸癌組織中的陽(yáng)性率分別為100.0%、70.0%和33.3%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明從癌前病變發(fā)展到浸潤(rùn)癌的過(guò)程中sFRP1可能起了重要作用。宮頸癌臨床Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ～Ⅳ期sFRP1陽(yáng)性表達(dá)率也呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，分別為50.0%、25.8%和7.7%，其中Ⅰ期的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期(P均<0.05)，且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，提示sFRP1的表達(dá)可能與宮頸癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)。

β-catenin是連環(huán)蛋白家族中一員，具有介導(dǎo)細(xì)胞黏附及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的雙重功能。β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)以兩種形式存在：一種為結(jié)合型，與E-cadherin結(jié)合參與調(diào)節(jié)同種細(xì)胞間的黏附；一種為游離型，參與Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑。游離的β-catenin可通過(guò)核膜進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄因子Tcf/Lef結(jié)合，激活Wnt途徑靶基因，如c-myc、cyclin D1，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖，參與腫瘤形成［10］。

Nakopoulou等［11］通過(guò)檢測(cè)141例乳腺癌標(biāo)本中β-catenin的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)β-catenin高表達(dá)與乳腺癌的侵襲性及不良預(yù)后有關(guān)。Wanitsuwan等［12］對(duì)163例結(jié)直腸癌研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin的細(xì)胞核異常表達(dá)率高達(dá)81.4%，并與腫瘤的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Sangkhathat等［13］通過(guò)在肝癌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染siRNAs引起細(xì)胞內(nèi)β-catenin表達(dá)下降，從而達(dá)到抑制肝癌細(xì)胞增生的作用。Chunga等［6］在宮頸癌CaSki細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)有β-catenin的異常聚集。

本研究結(jié)果表明，從正常宮頸組織發(fā)展為CIN再演變?yōu)閷m頸癌，β-catenin的異常表達(dá)逐漸增強(qiáng)，且宮頸癌組明顯高于其他兩組，提示β-catenin的異常積聚可能在宮頸上皮癌變過(guò)程中起重要作用。隨著Wnt信號(hào)通路拮抗劑sFRP1在宮頸癌組織中表達(dá)的逐漸減弱，β-catenin的異常表達(dá)程度呈逐漸增高趨勢(shì)。表明sFRP1的低表達(dá)可能是導(dǎo)致β-catenin正常表達(dá)下降、異常表達(dá)升高的因素之一，并且sFRP1與β-catenin的作用不是獨(dú)立的，而是共同作用促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果還證實(shí)，sFRP1、β-catenin的表達(dá)與宮頸癌的預(yù)后有關(guān)，可作為預(yù)測(cè)宮頸癌預(yù)后的指標(biāo)之一。

綜上所述，在宮頸癌組織中Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制蛋白sFRP1呈明顯的表達(dá)減弱或缺失，β-catenin的細(xì)胞膜表達(dá)減弱，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核的異常積聚增加，表明Wnt傳導(dǎo)通路在宮頸癌中處于激活狀態(tài)，提示該傳導(dǎo)通路與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。信號(hào)抑制蛋白sFRP1的表達(dá)減弱可能是導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)積聚以及Wnt信號(hào)活化的原因之一，并且sFRP1和β-catenin有望成為預(yù)測(cè)宮頸癌預(yù)后的指標(biāo)及生物靶向治療的靶點(diǎn)。

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