石英 翁艷潔 周文娟 周婷 陳剛 王常玉

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院婦產科，湖北 武漢 430030

卵巢癌是一種常見的嚴重威脅婦女生命健康的惡性疾病, 發(fā)病率僅次于宮頸癌和乳腺癌。由于缺乏有效的早期診斷篩選手段，且早期無明顯癥狀，70%的患者就診時已為晚期，其中上皮性卵巢癌占卵巢惡性腫瘤的85%～90%。雖然治療方法不斷改進，但預后仍較差，5年生存率無明顯改善［1］。有研究證據表明，卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多階段的過程，涉及多個基因的變化，因此發(fā)現新的腫瘤基因治療靶點，逐漸成為卵巢癌研究的熱點。

Stathmin又稱Op18 (Oncoprotein 18)，是一種重要的微管不穩(wěn)定蛋白，通過磷酸化和去磷酸化作用來調節(jié)細胞微管系統(tǒng)的動力學平衡與穩(wěn)定，控制細胞周期，并參與調節(jié)細胞增殖、分化等生物學行為［2］。去磷酸化的Stathmin可以將Tubulin分離成無功能的可溶性T2S復合體，使微管末端附近可利用的Tubulin數量減少，促進微管解聚，調節(jié)微管的解聚和組裝。同時，Stathmin參與調節(jié)細胞有絲分裂，特別是紡錘體形成。有絲分裂間期，非磷酸化Stathmin促進微管解聚，為有絲分裂期紡錘體生成奠定基礎。當細胞進入有絲分裂期，Stathmin主要以磷酸化形式存在，促解聚活性喪失，微管聚合，利于紡錘體形成；而在有絲分裂晚期，Stathmin又通過去磷酸化激活，促進紡錘體解聚，順利完成有絲分裂［3］。既往研究發(fā)現Stathmin在肺癌［4］、肝癌［5］、宮頸癌［6］等多種腫瘤中異常高表達，提示Stathmin可能參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，但具體機制尚未完全闡明。本研究通過檢測Stathmin在正常卵巢上皮、卵巢良性腫瘤和上皮性卵巢癌組織中的表達并分析其與臨床病理特征的關系，為卵巢癌的臨床靶向基因治療提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

收集武漢同濟醫(yī)院2008年12月—2010年10月行手術治療并經病理證實的卵巢組織標本。其中卵巢良性腫瘤16例，上皮性卵巢癌50例(漿液性囊腺癌33 例，黏液性囊腺癌12例，子宮內膜樣腺癌5例)，并以22例因宮頸癌手術行附件切除的正常卵巢作為對照。新鮮標本分兩部分，一部分置RNA Later液保存于-80 ℃冰箱中用于RNA提取及RT-PCR，另一部分用4%多聚甲醛固定后交武漢谷歌生物公司石蠟包埋切片后用于免疫組化。

1.2 主要試劑

組織RNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司，RT-PCR相關試劑購于北京全式金公司，SABC法兔抗免疫組化試劑盒購于武漢博士德公司，Stathmin兔抗人抗體購自美國Abcam公司。

1.3 免疫組化方法及結果判定

所有標本經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋連續(xù)切片后，按SABC法免疫組化試劑盒步驟進行。結果判定參照Sulzers分級法。按著色強度分4級：無陽性著色為0分；淺黃色陽性顆粒為1分；棕黃色陽性顆粒為2分；棕褐色陽性顆粒為3分。按著色范圍分4級。Ⅰ級：無陽性細胞著色為0分；Ⅱ級：陽性細胞率≤25%為1分；Ⅲ級：陽性細胞率為26%～50%為2分；Ⅳ級：陽性細胞率≥51%為3分。隨機觀察5個高倍鏡視野，計數100個細胞的陽性率，求平均值。染色結果判定標準為著色強度與范圍之積：0分為陰性(-)，1～2分陽性(+)，3～6分中度陽性(++)，7～9分強陽性(+++)。分析結果時，≤2分為陰性，>2分為陽性。

1.4 組織RNA提取及RT-PCR

組織RNA提取依照TIANGEN RNAprep pure微量RNA提取試劑盒步驟進行。引物由上海Invitrogen公司合成，Stathmin上游引物為5’-TGAAAGACGCAAGTCCCAT-3’，下游引物5’-GGTAGCCCCTAAAACAACAT-3’，擴增產物長度為444 bp；GAPDH上游引物5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，下游引物為5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’，擴增產物長度為238 bp。循環(huán)參數設為95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行33個循環(huán)擴增，72 ℃終延伸10 min，4 ℃ 保存。各樣本PCR產物通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，應用凝膠成像掃描及分析系統(tǒng), 用各樣本的目的基因條帶灰度值與相應GAPDH條帶灰度值相比，求其比值。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用t檢驗和單因素方差分析，計數資料組間比較應用χ2檢驗和Fisher確切概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 RT-PCR方法檢測Stathmin mRNA在不同卵巢組織中的表達

各組PCR產物分別在444 bp及238 bp處見條帶(圖1)。分析后得出Stathmin mRNA在上皮性卵巢癌組織中的表達(1.608±0.121)明顯高于卵巢良性腫瘤(0.394±0.049)及正常卵巢上皮(0.537±0.068)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 免疫組化法檢測

Stathmin蛋白在不同卵巢組織中均表達。Stathmin蛋白表達陽性信號定位于腫瘤細胞的細胞質，呈淺黃、棕黃、棕褐色陽性顆粒。與正常卵巢組［9.09%(2/22)］、良性卵巢腫瘤組［31.25%(5/16)］相比，上皮性卵巢癌組的陽性表達率(74.00%，37/50)明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=35.91，P<0.01；χ2=9.57，P<0.01)，而正常卵巢組與良性卵巢腫瘤組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖2)。

2.3 Stathmin蛋白表達與上皮性卵巢癌臨床病理特征的關系

進一步研究發(fā)現，Stathmin蛋白表達與上皮性卵巢癌的臨床分期、組織分級、淋巴結轉移有關，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而與年齡、病理類型及腹水量無相關性(表1)。

表1 Stathmin蛋白表達與上皮性卵巢癌臨床病理特征的關系Tab.1 The relationship between Stathmin protein expression and clinicopathological characteristics in epithelial ovarian cancer

3 討 論

尋找特異性的標志物已成為卵巢癌診斷和病情監(jiān)測的拓展領域之一。許多標志物包括CA125、CA72-4、CA199和AFP等已被廣泛應用于臨床，但靈敏度和特異度不高。因此不斷尋找新的標志物并聯合檢測將更有效地應對卵巢癌的異質性。

Stathmin作為一種與細胞周期相關的微管調節(jié)蛋白，最初被發(fā)現在惡性淋巴瘤細胞中高表達，隨后證實在多種腫瘤中異常高表達，提示Stathmin可能參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Stathmin表達與正常細胞的增殖相關，但存在組織差異性。研究發(fā)現Stathmin在低分化肺癌和乳腺癌中高表達，推測Stahtmin可能與腫瘤細胞的過度增殖和分化不良相關［7-8］。Stathmin作為一種傳遞細胞外信號的細胞質磷蛋白，可與多種細胞因子、癌基因或抑癌基因表達產物相互作用，引起細胞內一系列生物學改變［3,9］。其中，野生型p53基因可通過抑制 Stathmin基因啟動子活性來參與Stathmin表達的負性調節(jié)，而Stathmin持續(xù)高表達會越過p53介導的G2/M期阻滯，促進腫瘤細胞的增殖與分化［10］。

本研究通過RT-PCR及免疫組化方法檢測Stathmin在卵巢癌組織中的表達，從基因和蛋白水平驗證了Stathmin在正常卵巢上皮及腫瘤組織中均有表達，且在上皮性卵巢癌中表達明顯升高；同時探討了Stathmin與卵巢癌臨床病理參數的關系，發(fā)現Stathmin的異常高表達與卵巢癌臨床分期、病理分級、淋巴轉移相關，即Stathmin在晚期低分化及伴淋巴轉移的癌組織中異常高表達，與 Price等［11］的研究結論一致，提示Stathmin與卵巢癌的分化不良有關，并可能參與卵巢癌的淋巴轉移。Trovik等［12］報道，Stathmin在子宮內膜癌轉移淋巴結中表達增高，并作為一種PI3K激酶抑制因子，促進子宮內膜癌的淋巴轉移。另外，研究組前期通過二維電泳聯合質譜分析技術，發(fā)現對順鉑敏感性不同的兩種卵巢癌細胞株之間存在多種差異表達蛋白，Stathmin即為其中之一，推測其可能在卵巢癌鉑類耐藥中發(fā)揮一定作用。

以上研究為探索Stahtmin在卵巢癌中的作用機制奠定了基礎，下一步將完善實驗思路：在體外，干預Stathmin的表達及功能，觀察對卵巢癌細胞株化療敏感性及侵襲轉移等生物學行為的影響；在體內，選擇適當的模式動物建立卵巢癌模型，尋找特異性的靶向藥物，有效致力于卵巢癌的臨床治療。

綜上所述，Stathmin在卵巢癌組織中異常高表達，可能與卵巢癌的分化不良、淋巴轉移及化療耐藥相關。Stathmin將可能成為卵巢癌新的標志物之一，并作為新靶點應用于臨床。

［1］ GADDUCCI A, COSIO S, ZOLA P, et al. Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer:a review of the literature ［J］. Int J Gynecol Cancer, 2007,17(1): 21- 31.

［2］ MISTRY S J, ATWEH G F. Role of Stathmin in the regulation of the mitotic spindle: potential applications in cancer therapy［J］. Mt Sinai J Med, 2002, 69 (5): 299-304.

［3］ RUBIN C I，ATWEH G F. The role of oncoprotein 18 in the regulation of the cell cycle［J］. J Coil Biochem, 2004, 93(2):242-250.

［4］ CHEN G, WANG H, CHARIB T G, et al. Overexpression of oncoprotein 18 correlates with poor differentiation in lung adenocarcinomas ［J］. Mol Cell Proteomies, 2003, 2 (2):107-116.

［5］ 董旭旸, 易繼林, 李興睿. Stathmin/Oncoprotein 18(Op18)在肝細胞癌中的表達及其意義［J］. 胃腸病學和肝病學雜志, 2007, 4(16): 39-42.

［6］ XI W, RUI W, FANG L, et al. Expression of stathmin/op18 as a significant prognostic factor for cervical carcinoma patients［J］. Cancer Res Clin Oncol, 2009, 135(6): 837-846.

［7］ CHEN G, WANG H, GHARIB T G, et al. Overexpression of oncoprotein 18 correlates with poor differentiation in lung adenocarcinomas［J］. Mol Cell Proteomics, 2003, 2(2): 107-116.

［8］ BRATTSAND G. Correlation of oncoprotein 18/stathmin expression in human breast cancer with established prognostic factors［J］. Br J Cancer, 2000, 83(3):311-318.

［9］ WITTMANN T, BOKOCH G M, WATERMAN-STORER C M. Regulation of microtubule destabilizing activity of Op18 /Stathmin downstream of Rac1 ［J］. J Biol Chem, 2004, 279(7): 6196-6203.

［10］ JOHNSEN J I, AURELIO O N, KWAJA Z, et al. p53 mediated negative regulation of Stathmin/Op18 expression is associated with G2/M cell cycle arrest ［J］. Int J Cancer, 2000, 88 (5):685-691.

［11］ PRICE D K, BALL J R, BAHRANI-MOSTAFAVI Z, et al.The phosphoprotein Op18/stathmin is differentially expressed in ovarian cancer ［J］. Cancer Invest, 2000, 18(8): 722-730.

［12］ TROVIK J STEFANSSON I M, MARCICKIEWICZ J, et al.Stathmin overexpression identifies high risk patients and lymph node metastasis in endometrial cancer ［J］. Clin Cancer Res, 2011, 17(10): 3368-3377.