張立群 孫照剛 高孟秋 馬麗萍 吳曉光 劉菲

結(jié)核分枝桿菌是導致全球1／3人口感染結(jié)核病的致病菌，到目前為止，對它的致病機制還未完全闡明。miRNA是一類廣泛存在于真核細胞當中，長度約20nt的高度保守的微小的RNA分子，通過與對應的靶 mRNA 的3′非翻譯區(qū)（3′untranslated region，3′UTR）的非完全或完全配對結(jié)合，阻止其翻譯或破壞其穩(wěn)定性，實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控。研究表明miRNA在腫瘤、糖尿病和艾滋病等多種疾病中都起著重要作用［1-2］。

而有關(guān)miRNA在結(jié)核病發(fā)病機制中的研究卻少有報道。本研究應用miRNAs芯片篩選出肺結(jié)核患者和正常人外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中差異表達的miRNA，為進一步研究這些差異表達的miRNA在結(jié)核病發(fā)病機理中的作用打下基礎(chǔ)。

材料和方法

一、研究對象

肺結(jié)核患者共10例，痰抗酸桿菌陽性或臨床及影像學符合肺結(jié)核診斷，其中痰集菌（即收集患者24h痰，離心沉渣涂片抗酸染色找結(jié)核分枝桿菌）及培養(yǎng)陽性6例，根據(jù)臨床和影像學診斷肺結(jié)核4例。其中男6例，女4例，年齡18～55歲，平均年齡（35.2±14.4）歲，這10例患者均初次診斷為肺結(jié)核并未經(jīng)過抗結(jié)核治療。正常對照組10名，來自體檢正常人群，結(jié)核菌素試驗（PPD）陰性，其中男6名，女4名，年齡20～55歲，平均年齡（28.5±5.2）歲。

二、實驗試劑

miRNA分離試劑盒購自美國應用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems），miRNA標記及雜交試劑盒、洗脫緩沖液均購于美國安捷倫公司（Agilent），無RNA 酶的 DNA 酶（RNAsae－Free DNase）購自德國凱奇公司（Qiagen），人miRNA芯片采用安捷倫公司產(chǎn)品（型號G4470B）。

三、實驗方法

1.RNA抽提和質(zhì)量檢測：采集10例肺結(jié)核患者及10名正常對照者外周血5ml／人，枸櫞酸鈉抗凝。淋巴細胞分離液分離PBMC，分別將肺結(jié)核患者組和健康對照組的PBMC混合，加入Trizol裂解，根據(jù)RNA提取試劑盒（mirVana RNA Isolation Kit，Ambion）的操作步驟提取總RNA和miRNA，采用吸光度（A）值測定和電泳檢測其完整性，紫外分光光度計測定其濃度及純度。

2.miRNA的標記和純化：按Agilent公司的miRNA完全標記和雜交試劑盒（miRNA Complete Labeling and Hyb Kit）的說明書進行miRNA熒光標記和純化。

3.芯片雜交、圖像采集和數(shù)據(jù)處理：芯片檢測及分析由美國Agilent公司完成。

4.實時熒光定量PCR驗證：從有效的差異表達miRNA中選取3個 miRNA，分別為 hsa－miR－1、hsa－miR－146a與hsa－let－7e，進行實時定量 PCR 驗證以確保芯片實驗結(jié)果的可靠性。選擇肺結(jié)核患者及健康對照者各5例，再次抽取外周血1ml／人，枸櫞酸鈉抗凝。加入Trizol裂解，根據(jù)RNA提取試劑盒（mirVana RNA Isolation Kit）的操作步驟提取總RNA；利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（miScript Reverse Transcription Kit，Qiagen）將 RNA 逆 轉(zhuǎn) 錄 為cDNA，反應體系如下：反轉(zhuǎn)錄緩沖液 （5×）4μl，反轉(zhuǎn)錄酶1μl，無 RNA酶水14μl，模板 RNA 1μl。反應條件如下：37℃1h，95℃5min。實時熒光定量PCR利用miScript SYBR Green PCR kit（Qiagen）進行，反應體系如下：2×QuantiTect SYBR Green PCR混合液10μl，10×QuantiTect引物2μl，無RNA酶的水7.5μl，cDNA模板0.5μl。反應條件如下：95℃15min，然后是40次循環(huán)的94℃15s、55℃30s和72℃30s。以小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）U6作為內(nèi)參。最后，miRNA的實時定量PCR產(chǎn)物用非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測。miRNA的相對表達量采用2－△△Ct計算。

四、統(tǒng)計學處理

芯片結(jié)果的統(tǒng)計學意義判斷標準是校正后的兩個樣品間雜交信號強度的比值，以比值＞2或＜0.15代表有明顯的表達差異。實時定量PCR結(jié)果應用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，對定量資料進行獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、兩組樣品總RNA和miRNA質(zhì)量檢測結(jié)果

電泳結(jié)果顯示，兩組樣品總RNA均可見清晰的18S（S代表沉降系數(shù)）和28S條帶，樣品保存質(zhì)量較好（圖1）。對分離純化獲得的miRNA進行A值測定表明miRNA總量及質(zhì)量符合miRNA微陣列的檢測要求（表1）。

圖1 兩組樣品總RNA電泳圖

二、miRNA在肺結(jié)核組和對照組中的表達情況

對肺結(jié)核患者和健康對照者外周血單核細胞中has－miRNAs表達譜數(shù)據(jù)進行分析，芯片數(shù)據(jù)標準化處理后篩選出的26個差異表達的miRNA。在肺結(jié)核患者中顯著上調(diào)表達13個，下調(diào)表達的有13個（表2）。

表1 RNA樣品基本信息

表2 芯片數(shù)據(jù)標準化處理后篩選出的26個差異表達的miRNA

表3 肺結(jié)核患者和健康對照組中3個miRNA的表達比較（待測miRNA與內(nèi)參照U6的Ct值之比，x±s）

三、實時定量PCR驗證結(jié)果

為了驗證芯片結(jié)果的一致性，選取在芯片篩選中有差異表達的 miRNA：hsa-miR-1、hsa-miR-146a與hsa-let-7e進行實時定量PCR驗證。溫度曲線、熔解曲線和電泳結(jié)果顯示，反應過程順利，特異性良好，沒有非特異性擴增，表明實時定量PCR結(jié)果可靠。歸一化后的結(jié)果顯示，hsa-miR-1表達上調(diào)，hsa-miR-146a與hsa-let-7e表達下調(diào)，與芯片結(jié)果一致（表3）。

討 論

RNA曾經(jīng)被認為僅是DNA和蛋白質(zhì)之間的“過渡”，但越來越多的證據(jù)清楚地表明，RNA在生命進程中扮演的角色遠比人們估計的更為重要。近年的研究發(fā)現(xiàn)miRNA是一種可調(diào)節(jié)基因表達、調(diào)節(jié)生長發(fā)育和維持機體正常生理功能的一類重要小分子RNA。miRNA廣泛存在于哺乳動物細胞內(nèi)，具有強大的調(diào)控基因表達的作用，miRNA主要采用降解靶mRNA和抑制靶mRNA的翻譯兩種作用方式調(diào)控基因的表達［3］。生物信息學研究發(fā)現(xiàn)這些miRNA雖然只占人類基因總數(shù)的2%，卻調(diào)控著人類全基因組中30%以上的基因的表達，而且miRNA水平基因調(diào)控機制是全新的［4］。隨著新的miRNA的不斷發(fā)現(xiàn)，以及部分miRNA功能的明朗，使得miRNA的研究倍受關(guān)注，成為當前研究的熱點之一。對于人類基因組來說，在生長發(fā)育、分化和疾病過程中，基因表達的調(diào)節(jié)極其復雜，通過多系統(tǒng)相互作用來完成。于轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)往往比蛋白水平的調(diào)節(jié)更快捷且高效節(jié)能。單一miRNA就可以同時調(diào)節(jié)眾多的基因，這使得miRNA成為重要生理機能調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因素，如形態(tài)發(fā)生、細胞命運、對感染微生物的反應、著絲粒異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)等。經(jīng)文獻檢索，國內(nèi)外尚無關(guān)于miRNA在結(jié)核感染中作用的研究報道。國內(nèi)有學者已經(jīng)開始進行結(jié)核患兒循環(huán)miRNA表達譜的研究，另有學者正在進行小RNA在潛伏感染到活動性結(jié)核病進程中的作用的研究，但尚無階段性研究結(jié)果的報道。

在本次芯片篩選研究中，在肺結(jié)核患者組和健康對照組外周血單核細胞中發(fā)現(xiàn)26個差異表達的miRNA，其中有13個下調(diào)，13個上調(diào)。說明肺結(jié)核患者和健康對照者之間確實存在miRNAs表達差異。從此次的實驗數(shù)據(jù)可以看到，在肺結(jié)核患者中高表達的人類來源的miRNAs有miR－21、miR－340、miR－424、miR－301b、miR－1、miR－627等，低表達的人類來源的 miRNAs有l(wèi)et－7e、miR－146a、miR－552、miR－545、miR－136、miR－199a等。

雖然尚缺少miRNA在結(jié)核感染中的研究報道，筆者還不知道上述差異表達的miRNA在結(jié)核感染中的作用，但miRNA在免疫和呼吸系統(tǒng)中的研究已有不少報道。在過敏性氣道炎癥的研究中，Ezzie等［5］通過微陣列方法在多西環(huán)素誘導肺特異性IL－13轉(zhuǎn)基因小鼠（過敏性氣道炎癥）中發(fā)現(xiàn)21個miRNA差異表達。其中miR－21過表達、miR－1低表達。在肺癌的研究中，2004年Takamizawa等［6］首先報道了let－7與肺癌病因?qū)W有關(guān)，在肺癌組織中44%的患者let－7a表達降低，并與術(shù)后生存期縮短相關(guān)。2009年美國胸科協(xié)會（ATS）年會上發(fā)表的一篇研究摘要，對不同分期的慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者的肺組織進行了miRNA表達的檢測，校正年齡和吸煙因素后，結(jié)果顯示“全球自發(fā)性慢性阻塞性肺疾病組織（GOLD）”定義的1～2期COPD患者肺組織中miR－455和miR－199a表達上調(diào)，miR－324－5p和 miR－324－3p表達下降，GOLD 定義的2～4期的COPD患者miR－374表達上調(diào)，miR－324－3p表達下調(diào)，從GOLD 1至GOLD 4期，miR－374和 miR－199a表達上調(diào)，miR－324－3p表達下調(diào)［7］。使用Ingenuity Pathway分析軟件，分析miR－324－3p的靶基因及其相關(guān)生物路徑反應提示其與分子轉(zhuǎn)運和細胞發(fā)育、生長、增殖有關(guān)；對miR－199a的分析則提示其與細胞間的信號傳遞和組織生長有關(guān)，研究者認為不同的miRNA表達譜有助于區(qū)分不同的GOLD分期的COPD患者，并與COPD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［7］。上述研究提示，筆者篩選出的部分差異表達的miRNA參與了細胞間的信號傳導和細胞的發(fā)育生長和增殖，在結(jié)核感染中的作用有待進一步研究。

特別值得注意的是在肺結(jié)核患者中hsa－miR－146a的顯著低表達。目前的研究表明hsa－miR－146a是與免疫相關(guān)的miRNA，在免疫系統(tǒng)中miRNA可通過調(diào)節(jié)免疫細胞分化、免疫細胞信號轉(zhuǎn)導、固有免疫應答和適應性免疫應答等多個層面對免疫反應各個水平執(zhí)行較為柔和精細的微調(diào)［8］。在固有免疫應答中，Toll樣受體（toll like receptor，TLR）家族是一類近年來研究比較熱門的病原體相關(guān)模式受體，TLR與配體結(jié)合后首先導致白介素1受體相關(guān)激酶1 （interleukin 1receptor associated kinase 1，IRA K1）和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）等接頭蛋白的募集，然后進一步向下級聯(lián)傳導信號，最終通過磷酸化的下游轉(zhuǎn)錄因子激活包括干擾素在內(nèi)的大量細胞因子的產(chǎn)生。研究顯示miRNA－146a作為一個負調(diào)控分子，其可通過互補結(jié)合于IRA K1和TRAF6的 3′端非翻 譯 區(qū) （untranslated region，UTR），在轉(zhuǎn)錄后水平抑制TRAF6和IRA K1的表達，從而對固有免疫應答中細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導起一種負反饋調(diào)節(jié)作用［9］。本研究結(jié)果顯示 miR－146a表達水平在肺結(jié)核患者中明顯低于正常對照組，提示miR－146a參與了肺結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展的過程。

眾所周知，PCR擴增會對芯片結(jié)果引入誤差［10］，且miRNA的量遠少于RNA。本研究中，為得到足量的miRNA，筆者每組選取了10例（名）受試者，各抽取5ml空腹靜脈血，先將提取的PBMC混合，進而提取總RNA和miRNA，進行芯片實驗。混合標本得到的結(jié)果消除了miRNA的個體差異，也有利于消除多次芯片實驗間的誤差。

筆者將在后續(xù)實驗中針對篩選出來的肺結(jié)核差異表達的部分miRNA，在較大的樣本中采用實時定量PCR方法加以驗證，結(jié)合患者的臨床病理資料分析其臨床意義，并通過體內(nèi)外實驗進一步研究相關(guān)miRNA的生物學功能。

［1］Calin GA，F(xiàn)erracin M，Cimmino A，et al.A MicroRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia.N Engl J Med，2005，353 （17）：1793－1801.

［2］Lu J，Getz G，Miska EA，et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers.Nature，2005，435（7043）：834－838.

［3］Rana TM.Illuminating the silence：understanding the structure and function of small RNAs.Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8（1）：23－36.

［4］Lewis BP，Burge CB，Bartel DP.Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands of human genes are microRNA targets.Cell，2005，120（1）：15－20.

［5］Ezzie ME，Yu L，Batte K，et a1.A distinct microRNA profile distinguishes GOLD stages in COPD.Am J Respir Crit Care Med，2009，179：A2493.

［6］Takamizawa J，Konishi H，Yanagisawa K，et al.Reduced expression of the let－7microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival.Cancer Res，2004，64：3753－3756.

［7］Lu TX，Munitz A，Rothenberg ME.MicroRNA－21is upregulated in allergic airway inflammation and regulates IL－12p35 expression.J Immunol，2009，182：4994－5002.

［8］Rodriguez A，Vigorito E，Clare S，et al.Requirement of bic／microRNA－155for normal immune function.Science，2007，316（5824）：608－611.

［9］Taganov KD，Boldin MP，Chang KJ，et al.NF－kappaB－dependent induction of microRNA miR－146，an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103（33）：12481－12486.

［10］Sarwal MM.Chipping into the human genome：novel insights for transplantation.Immunol Rev，2006，210：138－155.