黃玉平 屈亞虹 馬振亞 王瑜 馬樺 朱寧 侯建中

我國是全球27個耐多藥肺結(jié)核高負(fù)擔(dān)國家之一，耐多藥肺結(jié)核已經(jīng)成為我國有效控制結(jié)核病的嚴(yán)重障礙［1］，危害著人們的身心健康。耐多藥肺結(jié)核不但傳播危害嚴(yán)重、治療難，而且診斷也很困難。傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗診斷方法一般需要3個月，由于診斷需要時間長，在確診為耐多藥肺結(jié)核之前不但傳染了其他人，并且用現(xiàn)有的初、復(fù)治化療方案治療可能會進(jìn)一步擴大耐藥譜，因此急需研發(fā)快速檢測耐多藥肺結(jié)核的診斷方法。

為了進(jìn)一步驗證線性探針技術(shù)（Hain Geno－Type?MTBDRplus，簡稱HAIN）快速診斷耐多藥肺結(jié)核在基層結(jié)核病防治工作中的可行性，開封市結(jié)核病防治所于2010年應(yīng)用HAIN對459例涂陽肺結(jié)核患者痰標(biāo)本進(jìn)行快速檢測耐多藥肺結(jié)核，并與傳統(tǒng)方法結(jié)核菌培養(yǎng)和藥敏試驗作對照分析。

資料和方法

一、研究對象

2010年4—10月開封市結(jié)核病防治所和所轄5縣結(jié)核病防治所登記管理的初、復(fù)治涂陽肺結(jié)核患者。

二、實驗方法

（一）標(biāo)本收集

縣結(jié)核病防治所對每例痰涂片陽性患者留取3份痰標(biāo)本，痰標(biāo)本于4～8℃冰箱保存，3d內(nèi)運送到市結(jié)核病防治所。市結(jié)核病防治所收到痰標(biāo)本后，連同本所發(fā)現(xiàn)的陽性痰標(biāo)本，24h內(nèi)進(jìn)行羅氏培養(yǎng)和HAIN檢測。

（二）HAIN檢測方法［2］

1.提取DNA：取500μl處理后痰標(biāo)本加入1.5ml離心管內(nèi)，10000×g離心15min；棄上清，加入500μl去離子水，渦旋震蕩重懸沉淀物。10000×g離心15min；95℃水浴中孵育20min；超聲裂解15min。12000×g離心10min，取5μl上清液用于PCR檢測。

2.擴增：在PCR儀上設(shè)置以下程序進(jìn)行擴增：15min 95℃，1個循環(huán)；30s95℃、2min 58℃10個循環(huán)；25s95℃、40s53℃、40s70℃30個循環(huán)；8min 70℃1個循環(huán)；4℃1個循環(huán)。

3.雜交：將PCR擴增產(chǎn)物和變性裂解液（DEN）各20μl混勻加入雜交反應(yīng)板，孵育5min，然后加入雜交緩沖液（HYB）1ml，混勻，將標(biāo)記好的探針試條加入槽中，在雜交儀上45℃孵育30min后將雜交液徹底吸出，再加入1ml嚴(yán)格漂洗液（STR），45℃雜交儀孵育15min。在每個槽中加入1ml按1∶100稀釋的標(biāo)志物，雜交儀振動平臺上孵育30min。再向每個槽中1∶100稀釋的底物并靜止避光孵育5～10min。將試條取出置于吸水紙上干燥，然后粘貼在判讀表上。

4.判讀：HAIN試條共有27個反應(yīng)條帶，可分為4個區(qū)（圖1）。后三區(qū)均為耐藥相關(guān)基因探針區(qū)。第二區(qū)是與利福平耐藥相關(guān)的rpoB基因探針組。第三區(qū)和第四區(qū)分別是與異煙肼耐藥相關(guān)的katG基因探針組和inhA基因探針組。這三區(qū)均是第一條帶為基因位點質(zhì)控帶，后面為野生位點探針和突變位點探針。判讀時野生條帶都顯色，而突變條帶不顯色判為敏感；而野生條帶有缺失，突變條帶無論顯色或不顯色均判為耐藥（圖2）。

圖1 每個探針試條的27個反應(yīng)條帶

圖2 判讀實例

（三）結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和藥敏方法

參照文獻(xiàn)［3］的方法，痰標(biāo)本經(jīng)標(biāo)本消化液（10ml 4%氫氧化鈉、10ml 2.94%檸檬酸三鈉、20mg N－乙酰－L－半胱氨酸）前處理，培養(yǎng)基為改良中性羅氏培養(yǎng)基。藥敏試驗用比例法，觀察RFP、INH耐藥情況。

結(jié) 果

一、兩種方法耐藥檢測分析

對459例既進(jìn)行HAIN檢測又進(jìn)行傳統(tǒng)培養(yǎng)和藥敏試驗的陽性痰標(biāo)本結(jié)果進(jìn)行對照分析。HAIN檢測與傳統(tǒng)藥敏檢測RFP耐藥率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝0.038，P＞0.05）；INH耐藥率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝0.231，P＞0.05）。其傳統(tǒng)培養(yǎng)藥敏試驗和HAIN檢測459例患者耐藥情況見表1。

表1 兩種方法檢測459例患者耐RFP、INH情況

表2 同一標(biāo)本HAIN檢測與傳統(tǒng)藥敏結(jié)果對比（例）

二、對同一標(biāo)本傳統(tǒng)藥敏試驗和HAIN檢測結(jié)果對照分析

兩種方法檢測對RFP均敏感者427例，均耐藥者24例，均耐多藥者12例，二者結(jié)果一致率98.3%（451／459）；對INH 均敏感者410例，均耐藥者37例，均耐多藥者12例，二者結(jié)果一致率97.4%（447／459）（表2）。

三、與傳統(tǒng)培養(yǎng)藥敏試驗相比

HAIN檢測耐RFP靈敏度82.8%（24／29），特異度 99.3% （427／430）；耐INH靈敏度80.4%（37／46），特異度99.3%（410／413）。同一標(biāo)本兩種檢測方法結(jié)果見表2。

討 論

傳統(tǒng)的耐多藥肺結(jié)核診斷方法是對患者的痰標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗，需要2～3個月時間得到結(jié)果，不能解決耐多藥肺結(jié)核患者的早期診斷問題。個別患者由于治療不及時導(dǎo)致治愈率下降，甚至確診時已經(jīng)死亡。由于傳統(tǒng)藥敏試驗待診時間過長，對指導(dǎo)臨床治療意義有限，患者和醫(yī)生不樂于接受，導(dǎo)致大部分耐多藥肺結(jié)核患者沒有得到及時發(fā)現(xiàn)而在社會上傳播他人。因此，探索、驗證快速診斷耐多藥肺結(jié)核方法，是控制耐多藥結(jié)核病疫情的重要手段。

線性探針技術(shù)用于耐多藥肺結(jié)核診斷，在我國僅有個別報道，都是對培養(yǎng)后的分離株進(jìn)行檢測，目前尚無基層結(jié)核病防治工作中應(yīng)用該技術(shù)對臨床標(biāo)本直接進(jìn)行檢測的報道。

本研究通過對459例肺結(jié)核患者涂片陽性痰標(biāo)本直接提取結(jié)核分枝桿菌DNA，擴增后，與標(biāo)記好的探針試條雜交，根據(jù)與RFP耐藥相關(guān)的rpoB基因探針組、與INH耐藥相關(guān)的katG或inhA基因探針組顯色情況，判定是否耐藥。該技術(shù)操作時間不超過24h。解決了傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗需時間過長問題，為患者早期治療提供了保證。

本研究結(jié)果顯示線形探針技術(shù)檢測與傳統(tǒng)藥敏試驗比較，二者耐RFP一致率達(dá)98%，耐INH一致率達(dá)97%。檢測耐RFP靈敏度82.8%，特異度99.3%，耐INH靈敏度80.4%，特異度99.3%。與李強等［4］報道耐RFP靈敏度88.6%、特異度98.8%，耐INH靈敏度79.3%，特異度98.8%接近；低于菅記涌等［5］報道的耐 RFP靈敏度96.3%，耐INH 靈敏度85.3%?？赡芘c試驗標(biāo)本不同有關(guān)，本研究采用的是患者痰標(biāo)本直接檢測，后者采用的實驗室分離菌株。本組資料顯示開封市肺結(jié)核患者耐藥率較低，可能與初治患者比例高，納入分析的藥敏種類少有關(guān)，同時提示當(dāng)?shù)亟陙斫Y(jié)核病控制已見成效。

線形探針技術(shù)用于基層結(jié)核病防治中檢測耐多藥肺結(jié)核，具有時間短及特異度、靈敏度高的特點，為耐多藥肺結(jié)核的早發(fā)現(xiàn)、早治療提供了診斷依據(jù)，在縮短其傳播時間、提高治愈率、減輕疾病負(fù)擔(dān)、保護健康人群和控制結(jié)核病疫情等方面具有重大意義。但由于HAIN需要特殊設(shè)備和環(huán)境，操作技術(shù)和防污染措施要求嚴(yán)格，所以在縣級結(jié)核病防治機構(gòu)應(yīng)用仍有一定的難度。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部.全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報告（2007—2008）.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：1－3.

［2］中國疾病預(yù)防控制中心國家結(jié)核病參比實驗室.線形探針耐多藥檢測方法應(yīng)用評估實施細(xì)則.北京：中國疾病預(yù)防控制中心，2010：37－47.

［3］中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會.結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程.北京：中國教育文化出版社，2006：1－117.

［4］李強，趙雁林.197例臨床結(jié)核分枝桿菌分離株的快速耐藥性檢測報告.中國防癆雜志，2009，31（12）：709－712.

［5］菅記涌，王嫩寒，易俊莉，等.MTBDR plus方法快速檢測北京地區(qū)臨床結(jié)核分枝桿菌分離株利福平和異煙肼耐藥性效果評價.中國防癆雜志，2010，32（10）：611－614.