張波
替考拉寧(Teicoplanin)為新型糖肽類抗生素,抗菌譜及抗菌活性與萬古霉素相似,對金黃色葡萄球菌的作用比萬古霉素更強,不良反應更少。本品對革蘭陽性菌如葡萄球菌、鏈球菌、腸球菌和大多厭氧性革蘭陽性菌敏感,具有較強的殺菌活性。由于替考拉寧獨特的作用機制,很少出現(xiàn)耐替考拉寧的菌株,所以對青霉素類及頭孢菌素類,大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和氯霉素類,氨基糖苷類和利福平耐藥的革蘭陽性菌,仍對替考拉寧敏感[1,2]。本文采用高效液相色譜法,乙腈-磷酸鹽體系作為流動相,對發(fā)酵液中的替考拉寧含量測定方法進行研究,結果滿意。
Waters1525型液相色譜儀(美國Waters公司),UV100型紫外檢測器,替考拉寧對照品(中國藥品生物制品檢定所提供),替考拉寧樣品(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司);乙腈(色譜純,天津四友公司)。
2.1 色譜條件 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為磷酸鹽緩沖液(pH=6.0)-乙腈(75∶25),流速1.0 ml/min,檢測波長為 254 nm,進樣量 10 μl。
2.2 檢測波長的選擇 對替考拉寧對照品的流動相溶液進行紫外掃描,結果在254 nm附近有較大吸收,在此波長處發(fā)酵液無明顯干擾,故選擇254 nm作為檢測波長。
2.3 標準溶液的配制 精密稱取替考拉寧對照品約20 mg,置10 ml容量瓶中,振搖,用流動相溶解至刻度,作為供試品溶液,另取替考拉寧樣品適量,同法操作。
2.4 系統(tǒng)適用性試驗 取10 μl對照品溶液注入液相色譜儀,記錄色譜圖。在該色譜條件下,替考拉寧峰與其他雜質(zhì)峰分離度大于1.2。
2.5 破壞性試驗 稱取替考拉寧對照品各約200 mg,分別置于3個100 ml容量瓶中,分別加入1 mol/L鹽酸、1 mol/L氫氧化鈉,3%的過氧化氫溶液各10 ml,于室溫放置1 h,用流動相定容,作為破壞后的供試品溶液,分別取10 μl注入液相色譜儀,結果替考拉寧與雜質(zhì)分離良好。
2.6 線性關系 精密稱取替考拉寧對照品適量,分別制成每1 ml中含替考拉寧 500.0,1000.0,2000.0,3000.0,4000.0,5000.0 μg的溶液,注入液相色譜儀,以替考拉寧峰面積A為縱坐標,濃度C為橫坐標,計算得回歸方程為:
A=487939 C,r=0.9988
2.7 最低檢測限 采用逐級稀釋法,以S/N≥3為最低檢出限,測得最低檢測限為4.50ng。
2.8 精密度試驗 試驗按2.3項下配制的2000 μg/ml的溶液,連續(xù)進樣6次,計算其RSD為0.55%。
2.9 加樣回收率試驗 取已知含量的替考拉寧樣品,制成2.3項下濃度的替考拉寧供試品溶液,共6份,分別精密加入含已知量的對照品溶液,搖勻,取10 μl進樣,結果替考拉寧的平均回收率為100.2%(RSD=0.14%,n=6)。結果見表1
2.10 發(fā)酵液中樣品測定 取約20 ml發(fā)酵液用2 mol/L氫氧化鈉調(diào) pH=11,攪拌10 min,在3000轉/min下離心10 min,取上清液,以2 mol/L鹽酸調(diào)pH至8.5,取調(diào)后上清液,過濾。取稀釋配制成約2000 μg/ml的溶液,搖勻,過濾,取10 μl進樣,結果在此色譜條件下,發(fā)酵液中雜質(zhì)對主峰無干擾,分析重復性及精密度結果較滿意。
表1 加標回收率試驗結果
本文采用乙腈-磷酸鹽體系作為流動相對替考拉寧進行樣品測定,精密度好,色譜峰對稱性也較好,同時我們還對樣品溶液經(jīng)過不同時間的放置來檢驗樣品在溶液中的穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)樣品在本流動相溶液中相當穩(wěn)定,適宜于成品的檢測和發(fā)酵液中間體的質(zhì)量控制。
[1]夏振強,古勇,官家發(fā).糖肽類抗生素替考拉寧研究進展.天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2005,18(2):236-238.
[2]何禮賢,潘玨,陳世耀,等.替考拉寧治療革蘭陽性球菌感染的臨床研究.中華內(nèi)科雜志,2005,33(5):532-533.