朱曉紅 王曉梅 張艷萍 王 毅 馬 旭

國家人口計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所(北京，100081)

Y染色體無精子因子(AZF)微缺失是導(dǎo)致生精障礙的主要遺傳學(xué)原因之一［1］，常見于不育癥患者［2］。Y染色體微缺失篩查有預(yù)測價(jià)值并可影響臨床治療措施的選擇，因此目前臨床分子遺傳學(xué)科室已逐步開展染色體微缺失檢測工作。檢測基因缺失最常見的方法為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增技術(shù)，對于目的位點(diǎn)擴(kuò)增結(jié)果呈陰性的樣品除重復(fù)檢測以外，一般還需要用Southern雜交進(jìn)行確認(rèn)。因而基于多重PCR的技術(shù)僅僅可以作為基因缺失的篩查技術(shù)，而篩查還需要考慮操作的簡便性和篩查成本。為此，本研究比較了進(jìn)口20個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)與國產(chǎn)15個(gè)STSY染色體AZF 微缺失篩查試劑的穩(wěn)定性、重復(fù)性和有效性，為臨床分子遺傳實(shí)驗(yàn)室開展相關(guān)工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象

46例無精(43例)、少精癥(3例)患者來自國家人口計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所門診，所有患者均結(jié)婚2年以上。精液分析及無精癥、少精癥診斷按世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦方法和診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］進(jìn)行，即連續(xù)2次精液檢查分析并經(jīng)離心沉淀均無精子者為無精癥，精子密度＜5×106/ml者為少精癥。另外選擇2例已正常生育的男性為對照，2例正常生育女性為陰性對照，純水作為空白對照。

1.2 Y染色體AZF微缺失檢測

1.2.1 DNA提取采集外周血3ml，EDTA抗凝。按照血液基因組DNA提取試劑盒(購自北京天根生化科技公司)說明進(jìn)行DNA提取，－20℃保存。

1.2.2 20個(gè)STSAZF微缺失檢測Y染色體微缺失檢測試劑盒購自美國PROMEGA公司(Ca#MD1531 Lot#290463)，根據(jù)歐洲男科協(xié)會(huì)(EAA)和歐洲分子遺傳實(shí)驗(yàn)預(yù)控網(wǎng)(EMQN)檢測指南推薦的方法，應(yīng)用多重PCR技術(shù)進(jìn)行檢測。擴(kuò)增體系采用位于Y染色體的SMCX基因和ZFX/ZFY基因?yàn)镻CR擴(kuò)增內(nèi)對照。20個(gè)STS在Y染色體上的位置和擴(kuò)增體系組合見表1。反應(yīng)條件為:基因組DNA 2μl，引物混合液20μl，金牌 Taq 酶 0.5μl，純水 2.5μl，體系為 25μl。擴(kuò)增條件為:94℃ 2min，94℃ 1min，57℃ 30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。取PCR產(chǎn)物8μl加2μl 6×上樣緩沖液，充分混合均勻后經(jīng)4.0%瓊脂糖凝膠電泳(恒壓120V)40min，用培清 JS－680B全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)進(jìn)行DNA電泳條帶觀察。

表1 Y染色體微缺失檢測20個(gè)STS的遺傳和多重PCR分組信息

1.2.3 15個(gè)STSAZF微缺失檢測Y染色體微缺失檢測試劑盒購自深圳亞能公司(20110401)，根據(jù)EMQN檢測指南推薦的方法采用多重PCR技術(shù)進(jìn)行檢測。擴(kuò)增體系采用位于Y染色體的ZFX/ZFY基因?yàn)镻CR擴(kuò)增內(nèi)對照。15個(gè)STS的遺傳和多重PCR分組見表2。反應(yīng)條件為:基因組 DNA 2μl，純水9μl，引物混合液 9μl，體系為 20μl。擴(kuò)增條件為:95℃ 3min，95℃ 30s，59℃ 30s，72℃ 30s，35 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。取PCR產(chǎn)物8μl加2μl 6×上樣緩沖液，充分混合均勻后經(jīng)4.0%瓊脂糖凝膠電泳(恒壓120V)40min，用培清JS－680B全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行DNA電泳條帶的觀察。

表2 Y染色體微缺失檢測15個(gè)STS的遺傳和多重PCR分組信息

2 結(jié)果

2.1 Y染色體AZF缺失檢測

46例無精、少精患者中共發(fā)現(xiàn)Y染色體AZF微缺失9例，均為無精癥患者，總?cè)笔蕿?9.57%(9/46)。AZFa、AZFb、AZFc和 AZFd四個(gè)區(qū)域的缺失構(gòu)成比分別是 22.22%、37.5%、88.89% 和 88.89%。其中，AZFa單獨(dú)缺失1例、AZFc+d聯(lián)合缺失5例、AZFb+c+d聯(lián)合缺失2例，AZFa+b+c+d 1例。

圖1 無精癥和少精癥患者AZF缺失電泳圖舉例

2.2 商品化試劑的評(píng)價(jià)

2.2.1 20STS和15STS檢測試劑敏感性比較20STS復(fù)合擴(kuò)增體系的推薦DNA用量為50ng/PCR反應(yīng)，即5個(gè)復(fù)合擴(kuò)增體系的DNA用量為250ng;15STS推薦DNA用量為200～400ng/PCR反應(yīng)，4個(gè)復(fù)合擴(kuò)增體系的DNA用量為800ng。在實(shí)際檢測過程中，20STS與15 STS均使用相同的DNA用量，即2μl/反應(yīng)，約為100ng/反應(yīng)，如圖1所示泳道1～4、6～9是20STS擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道11～14是15STS擴(kuò)增產(chǎn)物，上述DNA用量均滿足兩者擴(kuò)增反應(yīng)的要求，15STS擴(kuò)增系統(tǒng)具有略高的敏感度。

圖2 20STS和15STS檢測靈敏度對比

2.2.2 20STS和15STS檢測試劑的穩(wěn)定性比較

20STS復(fù)合擴(kuò)增體系的推薦使用時(shí)間是2年，15STS推薦使用時(shí)間為6個(gè)月，保存條件均為－20℃。在本次檢測過程中，20STS與15STS均在有效期，陽性對照品擴(kuò)增結(jié)果良好。20STS試劑在本實(shí)驗(yàn)室包藏期超過1年，大于15STS檢測試劑的推薦有效期。

2.2.3 20STS與15STS檢測結(jié)果的一致性比較

46例無精、少精癥患者中，45例行Y染色體AZF微缺失檢測20STS與15STS結(jié)果一致。在YD－9個(gè)體中，AZFd區(qū)域SY145位點(diǎn)20STS未檢測到缺失而15STS檢測到缺失，但在AZFd區(qū)域的SY152位點(diǎn)20STS和15STS均檢測到缺失。

3 討論

Y染色體長臂AZF微缺失被認(rèn)為是引起男性生精障礙的常見的遺傳病因。微缺失的發(fā)生是大的重復(fù)序列同源重組造成［4］，因此細(xì)胞遺傳學(xué)和Y染色體AZF微缺失分析對輔助生育具有指導(dǎo)意義。目前，部分研究或臨床采用6STS進(jìn)行Y染色體長臂AZF微缺失的檢測［5］，獲得AZF微缺失的頻率較低。采用數(shù)目較少的檢測體系可能減少基因缺失者的檢出，故建議選擇多基因座系統(tǒng)檢測試劑完成Y染色體AZF微缺失篩查工作。

本文系統(tǒng)比較了20STS和15STS的檢測結(jié)果，46例無精、少精癥患者中有45例行Y染色體AZF微缺失檢測20STS與15STS結(jié)果一致。在YD－9個(gè)體中，AZFd區(qū)域SY145位點(diǎn)20STS未檢測到缺失而15STS檢測到缺失，但同在AZFd區(qū)域的SY152位點(diǎn)檢測到缺失，故考慮結(jié)果判定一致。推測造成此現(xiàn)象的原因可能由于20STS與15STS中SY145基因座所選擇的引物位置不同，兩者的產(chǎn)物長度一個(gè)為143bp，另一產(chǎn)物長140bp。由于個(gè)體在引物結(jié)合區(qū)的微小變異可能造成擴(kuò)增產(chǎn)物的丟失，而非實(shí)際DNA序列的缺失，故不同的擴(kuò)增試劑可能造成Y缺失檢測時(shí)個(gè)別基因座的假陰性或假陽性。

本研究嚴(yán)格依照EMQN檢測指南中闡述的質(zhì)量控制完成實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果表明國產(chǎn)試劑與進(jìn)口試劑具有相同的檢測穩(wěn)定性、重復(fù)性和有效性，故考慮國產(chǎn)試劑具有較高的性價(jià)比。

1 李座祥，王琳，唐文豪，等.Y染色體無精子癥因子區(qū)及男性不育相關(guān)基因研究進(jìn)展［J］.生殖醫(yī)學(xué)雜志，2005，14(3):176－81.

2 Simoni M，Bakker E，Krausz C，et al.EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of y － chromosomal microdeletions.State of the art 2004［J］.International Journal of Andrology，2004，27:240－249.

3 World Health Organization.WHO laboratory manual for the examination human semen and sperm －cervical mucus interaction［M］.5th ed.London:London Cambridge University Press，2009:4－33.

4 Ferlin A，Moro E，Rossi A，et al.The human Y chromosome’s azoospermia factor b(AZFb)region:sequence，structure，and deletion analysis in infertile men［J］.J Med Genet，2003，40(1):18 －24.

5 Mitra A，Dada R，Kumar R，et al.Screening for Y－chromosome micro－deletions infertile Indian males:Utility of simplified multiplex PCR［J］.Indian J Med Res，2008，127(2):124 －132.