朱瑜齡， 牛 平，曹恒恩， 孫 凡

近年來，越來越多的研究證實(shí)T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)在帕金森病(Parkinson’s disease，PD)發(fā)病機(jī)制中起重要作用。白細(xì)胞介素-17(Interleukin-17，IL-17，又稱 IL-17A)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種具有強(qiáng)大促炎作用的細(xì)胞因子，主要由新型效應(yīng)Th17細(xì)胞分泌的特異性效應(yīng)因子。記憶性CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用的γδ+T細(xì)胞也可不同程度的表達(dá)IL-17。IL-17與多種細(xì)胞表面的特異受體結(jié)合后，可誘導(dǎo)其產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子和趨化因子，如粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、趨化性細(xì)胞因子(CXCL8)、IL-8等，在炎癥發(fā)展、免疫應(yīng)答及免疫排斥反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用。近年來關(guān)于PD患者外周血、腦脊液及腦內(nèi)紋狀體區(qū) IL-1β、IL-2、4、6、10 和 TNF-α 等細(xì)胞因子異常的報(bào)道較多，但關(guān)于IL-17水平及其變化與PD的關(guān)系卻未見報(bào)道。因此，我們對(duì)PD患者血清IL-17水平進(jìn)行測(cè)定，并探討其變化的原因及相關(guān)因素。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選擇我院2010年10月～2011年5月門診就診的原發(fā)性PD患者43例，診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)制定的PD診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］。男27例，女16例，年齡45～85歲，平均64.25±10.23歲;病程0.5～12 年，平均3.48 ±3.39 年。排除近期感染(如近期發(fā)燒、和/或外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)超過正常)、腫瘤、免疫性疾病、長(zhǎng)期慢性感染、2個(gè)月內(nèi)應(yīng)用抗生素、應(yīng)用非甾體類抗炎藥及免疫抑制劑者。病情評(píng)估采用帕金森病統(tǒng)一評(píng)分量表第3部分(The United Parkinson＇s Disease Rate Scale Part III，UPDRS III)評(píng)分。正常對(duì)照組33例，為同期健康體檢者，男18例，女15例，年齡45～76歲，平均62.8±10.06歲，兩組性別及年齡匹配。

1.2 分組 PD組按年齡、性別、病程及不同治療情況進(jìn)行分組。

1.3 方法 肘正中靜脈采血2ml，自然凝固，1h內(nèi)離心，分離血清，分裝后保存于－80℃冰箱內(nèi)。采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunolsorbent Assay，ELISA)定量測(cè)定血清IL-17水平(IL-17試劑盒，上?；顦飞锟萍加邢薰?。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSSl7.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，各組間差異顯著性比較采用單因素方差分析(ANOVA)、t檢驗(yàn)，計(jì)量資料兩組間相關(guān)性采用Pearson直線相關(guān)分析，設(shè)定P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 PD組和對(duì)照組血清IL-17水平比較 PD組、對(duì)照組血清 IL-17 水平分別為 8.89ng/L、4.55 ng/L，PD組明顯高于對(duì)照組，差異極顯著(P＜0.01)(見表 1)。

2.2 不同性別、年齡、病程及治療狀況PD患者血清IL-17水平比較 PD組按性別分為兩組，組間比較無顯著性差異(P＞0.05);按年齡分為兩組，≦60歲組18例、＞60歲組25例，組間比較表明血清IL-17水平無顯著性差異(P＞0.05);按病程分為兩組，病程≦3年組21例、＞3年組22例，組間比較表明血清IL-17水平無顯著性差異(P＞0.05);按治療情況不同分為3組，未用藥組20例，未服用任何抗PD藥物;單藥組13例，僅服用多巴制劑或多巴受體激動(dòng)劑;聯(lián)合用藥組10例，服用多巴制劑、多巴受體激動(dòng)劑等兩種以上藥物。3組間比較均無顯著性差異(P＞0.05)。PD各組血清IL-17水平均高于對(duì)照組，差異極顯著(P＜0.01)(見表2)。

表1 PD組和對(duì)照組血清IL-17水平比較()

表1 PD組和對(duì)照組血清IL-17水平比較()

與對(duì)照組比較*P＜0.01

組別 例數(shù) IL-17(ng/L)對(duì)照組PD組33 43 4.55 ±1.19 8.89 ±2.45*

2.3 病情輕重與PD患者血清IL-17水平關(guān)系采用UPDRS III對(duì)PD患者進(jìn)行病情評(píng)估，評(píng)分越高，病情越重。對(duì)PD患者血清IL-17濃度與UPDRSIII評(píng)分兩組數(shù)據(jù)繪制散點(diǎn)圖顯示二者呈同向變化，進(jìn)行Pearson直線相關(guān)分析，結(jié)果顯示:PD患者血清IL-17水平與UPDRSIII評(píng)分呈顯著正相關(guān)(Rs=0.52，P ＜0.01)。

表2 不同年齡、性別、病程及治療狀況PD患者血清IL-17水平比較()

表2 不同年齡、性別、病程及治療狀況PD患者血清IL-17水平比較()

與對(duì)照組比較*P＜0.01

組別 例數(shù) IL-17(ng/L)對(duì)照組≦60歲組＞60歲組女性男性≦3年組＞3年組未用藥組單藥組聯(lián)合用藥組33 18 25 16 27 21 22 20 13 10 4.55 ±1.19 8.53 ±2.19*9.14 ±2.66*9.50 ±2.58*8.52 ±2.37*8.86 ±2.57*8.90 ±2.41*8.94 ±2.84*8.61 ±2.40*9.14 ±1.77*

3 討論

大量臨床和基礎(chǔ)研究證實(shí)不論小膠質(zhì)細(xì)胞激活的非特異性免疫反應(yīng)，還是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)均可導(dǎo)致多巴胺(DA)能神經(jīng)元變性死亡。PD患者尸檢證實(shí)黑質(zhì)區(qū)可見大量T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MPTP小鼠PD模型腦內(nèi)也同樣發(fā)現(xiàn)大量T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、并聚集于炎癥反應(yīng)嚴(yán)重的黑質(zhì)區(qū)［2，3］。另外，PD患者外周血中T淋巴細(xì)胞亞群比例失調(diào)也屢見報(bào)道［4］。這使PD免疫異常的原因及機(jī)制備受關(guān)注。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為腦內(nèi)T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的原因與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)慢性炎癥反應(yīng)狀態(tài)、小膠質(zhì)細(xì)胞激活及其分泌的細(xì)胞因子導(dǎo)致血腦屏障破壞、通透性增加有關(guān)，這是介導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)的淋巴細(xì)胞進(jìn)入CNS的前提和基礎(chǔ)。腦內(nèi)細(xì)胞粘附分子和趨化因子表達(dá)增加也可直接招募外周T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)至炎癥反應(yīng)區(qū)域。研究表明小膠質(zhì)細(xì)胞活化具有可塑性，可分為經(jīng)典的活化小膠質(zhì)細(xì)胞(M1)和選擇性活化小膠質(zhì)細(xì)胞(M2)［5］，兩者與侵入CNS內(nèi)的T淋巴細(xì)胞之間相互作用密切。活化的小膠質(zhì)細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子可促使T淋巴細(xì)胞增殖、分化為功能不同的T淋巴細(xì)胞亞群。M1型可促使T細(xì)胞增殖分化為CD4+Th1細(xì)胞，后者通過分泌IFN-γ反過來激活M1型小膠質(zhì)細(xì)胞，從而促進(jìn)DA能神經(jīng)元的丟失［6］;M2型則促使T細(xì)胞增殖分化為CD4+Th2細(xì)胞，后者通過分泌IL-10激活M2型小膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)DA能神經(jīng)元起保護(hù)作用。

最近研究發(fā)現(xiàn)輔助性T淋巴細(xì)胞中的新成員-Th17在PD病理過程中也起著重要作用。Th17細(xì)胞主要以分泌IL-l7為特征，它不同于Th1、Th2細(xì)胞，其分化依賴于其獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-孤獨(dú)受體(ROB-γt)。目前研究表明Thl7細(xì)胞主要與人類和動(dòng)物多種自身免疫性疾病相關(guān)。Reynolds等［7］將α-突觸核蛋白(α-synuclein)致敏后的Th17細(xì)胞移入MPTP預(yù)處理的小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)與單用MPTP處理的小鼠相比，其黑質(zhì)區(qū)DA能神經(jīng)元數(shù)目較后者多丟失了53%。他們認(rèn)為這與路易(Lewy)小體的主要成分-α-synuclein誘導(dǎo)Th17細(xì)胞產(chǎn)生的特異性免疫反應(yīng)參與并加速了PD黑質(zhì)DA能神經(jīng)元丟失有關(guān)。Lewy小體作為PD的最主要病理改變，主要存在于殘存的黑質(zhì)DA能神經(jīng)元內(nèi)，當(dāng)這些殘存DA能神經(jīng)元死亡崩解后，α-synuclein也隨之被釋放到胞外，并通過血液循環(huán)至局部淋巴結(jié)，誘發(fā)固有免疫和特異性免疫反應(yīng)。致敏的Th17細(xì)胞進(jìn)入CNS后，介導(dǎo)了與黑質(zhì)區(qū)α-synuclein的特異性免疫反應(yīng)，從而加速黑質(zhì)區(qū)DA能神經(jīng)元丟失［8］。本研究通過檢測(cè)PD患者血清中IL-17水平，探討其變化的原因并分析可能影響其變化的相關(guān)因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，PD組血清IL-17水平明顯升高。按不同年齡、性別、病程分組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明各組間均無顯著性差異，提示與這些因素?zé)o相關(guān)性。我們對(duì) PD組血清 IL-17水平與UPDRSIII神經(jīng)功能評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性分析，證實(shí)二者呈顯著正相關(guān)。推測(cè)其原因可能是隨著PD患者病情進(jìn)展、殘存的DA能神經(jīng)元死亡增加，大量α-synuclein釋放后作用于外周免疫系統(tǒng)，促使致敏Th17細(xì)胞數(shù)量增多，并增強(qiáng)其分泌釋放IL-17，通過特異性免疫應(yīng)答造成DA能神經(jīng)元損傷和丟失。

最近一項(xiàng)研究表明接受左旋多巴治療的PD患者外周血IL-15和調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)與分泌的趨化因子(RANTES)水平不僅顯著高于正常對(duì)照組，也高于未接受左旋多巴治療組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［9］。Bessler［10］等研究也證實(shí)左旋多巴可使 PD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)增加分泌IL-6和TNF-α。其機(jī)制可能與作為中樞神經(jīng)遞質(zhì)的多巴胺、還可能通過合成和釋放其他神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)影響外周免疫系統(tǒng)有關(guān)。盡管多巴胺對(duì)外周組織作用有限，但在外周組織和細(xì)胞中檢測(cè)到多巴胺及其受體的證據(jù)，說明它可能對(duì)外周免疫調(diào)節(jié)有著直接影響。然而，目前關(guān)于多巴胺對(duì)外周免疫系統(tǒng)的具體影響及作用機(jī)制仍不明確。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)未治療組、單用多巴制劑組及聯(lián)合用藥組PD患者血清IL-17水平進(jìn)行了組間比較，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，無顯著性差異，這與以往研究結(jié)果有所不同，提示多巴制劑可能通過作用于不同的免疫反應(yīng)途徑來影響PD的病程。

研究證實(shí)Thl7細(xì)胞和CD4+CD25+T(Treg)細(xì)胞產(chǎn)生于同一種前體細(xì)胞-初始CD4+T細(xì)胞。在誘導(dǎo)兩者分化的過程中，TGF-β起著十分重要的作用。TGF-β單獨(dú)存在時(shí)，可促使未致敏的初始CD4+T淋巴細(xì)胞分化為具有抗炎作用的CD4+CD25+T細(xì)胞;TGF-β與IL-6共存時(shí)，則可促使其向Thl7發(fā)育分化［11］。Reynolds 等［12］研究表明 CD4+CD25+T細(xì)胞能夠減輕活化小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并減少DA能神經(jīng)元的損傷和丟失，即有神經(jīng)保護(hù)作用;而CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞，如Thl7等與其作用恰好相反。以往研究發(fā)現(xiàn)PD患者外周血中IL-6、TGF-β水平均明顯增高，并與PD患者的臨床表現(xiàn)客觀測(cè)評(píng)相關(guān)。PD患者外周血中淋巴細(xì)胞的亞群也明顯改變，CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)目減少。因此我們推測(cè)，隨著 PD患者病情進(jìn)展，CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化增加，進(jìn)而向CD4+CD25+T分化減少，并使Th17細(xì)胞分泌釋放IL-17增加，導(dǎo)致CNS炎癥反應(yīng)持續(xù)存在和加重，故同時(shí)檢測(cè)PD患者外周血Th17細(xì)胞數(shù)量及血清IL-17水平對(duì)進(jìn)一步探討其在PD發(fā)病機(jī)制中的作用意義可能更為重大。

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