張應(yīng)輝，蔣 帆，吳 雪（解放軍第181醫(yī)院藥劑科，桂林市 541002）

平安丸[1]是由木香、丁香[2]、沉香、香附、青皮、茯苓等19味藥組成的復(fù)方中藥制劑。用于治療肝氣犯胃引起的胃痛、脅痛、吞酸倒飽、呃逆、脘腹脹滿等證。方中以木香行氣調(diào)中、和胃止痛，香附疏肝理氣、解郁止痛，共為君藥；陳皮理氣調(diào)中，枳實、青皮、檳榔破氣消積，沉香行氣止痛、降逆和胃，山楂、麥芽、六神曲消食和中，豆蔻、砂仁化濕行氣、溫中止嘔，共為臣藥；延胡索活血以行氣，肉豆蔻、丁香、母丁香溫中降逆，茯苓、白術(shù)、草果仁健脾燥濕，共為佐藥。綜合全方，具有疏肝理氣、和胃止痛之功。為了更全面地控制該制劑的質(zhì)量，筆者對青皮、陳皮、枳實、肉豆蔻、木香、延胡索進行了薄層色譜（TLC）定性鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法對方中橙皮苷[3，4]進行了含量測定及相應(yīng)方法學(xué)的考察。

1 儀器與試藥

2965、2996HPLC系統(tǒng)（美國Waters公司）。

平安丸樣品（北京同仁堂（集團）有限責(zé)任公司，批號：6013876、6013877、6013878）；橙皮苷、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯對照品和肉豆蔻、延胡索對照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為 110721-200512、111524-200503、111525-200404、120926-200505、110736-200422）；硅膠G（青島海洋化工有限公司）；甲醇（色譜純，天津四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)開發(fā)公司）；水為純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 青皮、陳皮、枳實的TLC鑒別 取本品10 g，剪碎，加硅藻土5 g，研勻，加甲醇50 mL，超聲處理30 min（功率：250 W，頻率：40 kHz），過濾，濾液蒸干，殘渣用乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液；取缺枳實、缺陳皮、缺青皮及3種藥均缺的陰性樣品，同法分別制成缺枳實、缺陳皮、缺青皮及3種藥均缺的陰性對照溶液；另取橙皮苷對照品，加甲醇制成飽和溶液，作為對照品溶液。照TLC法[3]試驗，分別吸取以上各溶液5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100∶17∶13）為展開劑，展至約3 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20∶10∶1∶1）的上層溶液為展開劑，展至約8 cm，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；陰性對照無干擾。青皮、陳皮、枳實的TLC見圖1。

2.1.2 肉豆蔻的TLC鑒別取本品10 g，剪碎，加硅藻土5 g，研勻，加石油醚（30～60℃）50 mL，浸泡過夜，過濾，濾液揮干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液；取缺肉豆蔻的陰性樣品，

圖1 青皮、陳皮、枳實的TLC1.缺陳皮、青皮、枳實陰性對照；2.缺枳實陰性對照；3.缺陳皮陰性對照；4.缺青皮陰性對照；5～7.供試品；8.橙皮苷對照品Fig1 TLC of Citrus reticulata，C.reticulata，Aurantii Fructus Immature1.negative control without C.reticulata，C.reticulata，Aurantii Fructus Immature；2.negative control without Aurantii Fructus Immature；3.negative control without C.reticulata；4.negative control without C.reticulata；5～7.test samples；8.hesperidin control

同法制成陰性對照溶液；另取肉豆蔻對照藥材5 g，同法制成對照藥材溶液。照TLC法[3]試驗，吸取上述溶液各5μL，點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-甲苯-甲酸（10∶10∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以香草醛硫酸試液，于105℃加熱至顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾。肉豆蔻的TLC見圖2。

2.1.3 木香的TLC鑒別 取本品10 g，剪碎，加硅藻土5 g，研勻，加乙醚50 mL，浸泡過夜，過濾，濾液揮干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液；取缺木香的陰性樣品，同法制成陰性對照溶液；另取木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯對照品，加三氯甲烷分別制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照TLC法[3]試驗，吸取以上溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯（19∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以香草醛硫酸試液，于105℃加熱至顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾。木香的TLC見圖3。

2.1.4 延胡索的TLC鑒別

取本品20 g，剪碎，加硅藻土10 g，研勻，加二氯甲烷50 mL、氨水1 mL調(diào)至堿性，超聲處理30 min（功率：250 W，頻率：40 kHz），過濾，濾液蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液；另取延胡索對照藥材1 g，加甲醇50 mL，超聲處理30 min（功率：250 W，頻率：40 kHz），濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，加濃氨試液調(diào)至堿性，用乙醚振搖提取3次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為對照藥材溶液；按處方中藥味比例，自配不含延胡索的群藥，照供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。照TLC法[3]試驗，吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一用硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60℃）-丙酮-乙酸乙酯（84∶15∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置碘缸中約3 min后取出，揮盡板上吸附的余碘，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾。延胡索的TLC見圖4。

2.2 橙皮苷的含量測定

圖2 肉豆蔻的TLC1.缺肉豆蔻陰性對照；2～4.供試品；5.肉豆蔻對照藥材Fig 2 TLC of Myristica fragrans1.negative control without M.fragrans；2～4.test samples；5.Myristicae Semen control

圖3 木香的TLC1.缺木香陰性對照；2～4.供試品；5.去氫木香內(nèi)酯對照品；6.木香烴內(nèi)酯對照品Fig 3 TLC of Aucklandia lappa1.negative control without A.lappa；2～4.test samples；5.dehydrocostunolide control；6.costunolide control

2.2.1 色譜條件色譜柱：SB-C18（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（33∶67）；檢測波長：284 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL·min-1。理論板數(shù)按橙皮苷色譜峰計算應(yīng)不少于2 000。在此條件下，樣品中橙皮苷與其他組分均能達到基線分離。色譜見圖5。

2.2.2 溶液的制備 （1）對照品溶液：精密稱取橙皮苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含橙皮苷0.10 mg的溶液，即得。（2）供試品溶液：取本品0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min（功率：250 W，頻率：50 kHz），放冷，再稱定重量，用甲醇補足失重，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，即得。（3）陰性對照溶液：按處方中藥味比例，配成不含青皮、陳皮和枳實的樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

圖4 延胡索的TLC1.缺延胡索陰性對照；2～4.供試品；5.延胡索對照藥材Fig4 TLC of Corydalis yanhusuo1.negative control without C.yanhusuo；2～4.test samples；5.Corydalis Rhizoma control

圖5 高效液相色譜圖A.缺陳皮、青皮和枳實陰性對照；B.橙皮苷對照品；C.供試品Fig5 HPLC chromatogramsA.negative control without C.reticulata，C.reticulata，Aurantii Fructus Immature；B.hesperidin control；C.test samples

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取0.10 mg·mL-1的橙皮苷對照品溶液0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。分別精密吸取20 μL，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，橙皮苷進樣量（x）為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，得回歸方程為y＝2 180 640.93x+14 982.03（r＝0.999 9，n＝6）。結(jié)果表明，橙皮苷進樣量在0.1～1.1 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.2.4 精密度試驗 精密吸取同一批平安丸（批號：6013876）供試品溶液，按上述色譜條件進樣6 μL，測定峰面積，重復(fù)6次。結(jié)果，RSD＝0.16%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗 取同一批樣品（批號：6013876）適量，共6份，按供試品溶液的制備方法處理后，照上述色譜條件測定。結(jié)果，RSD＝0.96%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批（批號：6013876）樣品6份，每份0.25 g，分別精密加入0.322 5 mg·mL-1的橙皮苷對照品溶液5.0 mL，按供試品溶液制備方法處理，照上述色譜條件測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.2.7 樣品含量測定 分別取3批樣品，照上述色譜條件進樣測定。結(jié)果，3批樣品（批號：6013876、6013877、6013878）的橙皮苷含量分別為7.025、6.668、6.673 mg·g-1。由此結(jié)果可規(guī)定，本品含橙皮以橙皮苷（C28H34O15）計，每丸不少于24.0 mg。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 1Results of recovery tests（n＝6）

3 討論

處方中青皮、陳皮、枳實三者化學(xué)成分近似[5]，有5種相同的黃酮類成分和4種相同的胺類成分，其中均以橙皮苷含量最高，故本研究中3種中藥的定性鑒別和含量測定均以橙皮苷為標(biāo)準(zhǔn)。

本標(biāo)準(zhǔn)采用TLC法對方中青皮、陳皮、枳實、肉豆蔻、木香、延胡索進行了定性鑒別，可鑒別出青皮、陳皮、枳實、肉豆蔻、木香、延胡索的特征斑點且陰性對照無干擾，鑒別條件專屬性及重現(xiàn)性良好，能夠有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。

本試驗測定橙皮苷含量時采用HPLC法，分離效能高，分析速度快，操作穩(wěn)定性好，回收率高，重復(fù)性好，處方中其他成分對測定沒有干擾，可有效控制該制劑的內(nèi)在質(zhì)量。

筆者進行含量測定時，曾試用甲醇-水（40∶60）、甲醇-0.1%磷酸溶液（35∶65）、甲醇-0.1%磷酸溶液（33∶67）為流動相。結(jié)果，以甲醇-0.1%磷酸溶液（33∶67）分離最好，色譜峰能達到基線分離。取橙皮苷對照品，在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在284 nm波長處有最大吸收，故選擇284 nm作為檢測波長。本制劑為丸劑，參考《中國藥典》，根據(jù)橙皮苷的性質(zhì)，選擇70%乙醇、95%乙醇、甲醇作為提取溶劑，采用超聲提取和回流提取2種方法比較，同時進行了超聲時間和溶劑量的考察。結(jié)果表明，用甲醇超聲提取方法提取30 min得到的橙皮苷含量明顯高于其他方法；同時，0.5 g樣品使用甲醇50 mL已足以完全提取橙皮苷。

[1]陳可驥主編.慈禧光緒醫(yī)方選議[M].北京：中華書局，1981：141.

[2]張軍鋒，張樹軍.丁香屬植物的化學(xué)成分和藥理作用的研究進展[J].海南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，25（2）：200.

[3]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄36、附錄34.

[4]林 清，吳雪梅，馬曉鸝，等.HPLC法測定健脾顆粒中橙皮苷的含量[J].中國藥房，2009，20（9）：698.

[5]陳 紅，劉傳玉，李承晏.青皮的化學(xué)及藥理作用研究進展[J].中草藥，2001，32（11）：1 050.