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        粗毛牛膝帶腋芽莖段的植株再生研究

        2011-11-09 08:38:26劉葉蔓謝果珍湖南中醫(yī)藥大學(xué)長沙市410208
        中國藥房 2011年35期
        關(guān)鍵詞:生長研究

        劉葉蔓,謝果珍(湖南中醫(yī)藥大學(xué),長沙市 410208)

        粗毛牛膝Achyranthes bindentataBL.是莧科多年生草本植物。其根、種子、莖和葉中含有蛻皮甾酮、土牛膝皂苷、生物堿等。藥理研究表明,其不同溶劑提取物在強(qiáng)心、抗生育、抗菌和癌細(xì)胞凋亡等方面有明顯的影響[1]。植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展為藥用植物有效成分的工廠化生產(chǎn)提供了一條有效的途徑。近年來,關(guān)于懷牛膝、川牛膝組織培養(yǎng)方面的研究已有報(bào)道[2~4],但至今仍無粗毛牛膝在組織培養(yǎng)方面的報(bào)道。因此,筆者對粗毛牛膝的組織培養(yǎng)進(jìn)行了初步研究,并獲得了再生植株。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器

        AF1004型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱(中新醫(yī)療儀器有限公司);KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);超凈工作臺(蘇州三興凈化科技有限公司)。

        1.2 試藥

        基本培養(yǎng)基、萘乙酸(NAA)、6-芐基嘌呤(6-BA)均由上海艾研生物科技有限公司提供。

        1.3 外植體

        以粗毛牛膝帶腋芽的嫩莖為外植體。

        2 方法

        2.1 外植體及處理

        外植體經(jīng)流水沖洗30 min、洗衣粉液浸洗5 min、清水清洗后,在超凈工作臺用75%的酒精振蕩浸潤2 min,用無菌水清洗4次,再用0.1%氯化汞消毒15 min,最后用無菌水清洗5次后接種在培養(yǎng)基上。

        2.2 培養(yǎng)基及激素配比

        選用L9(34)正交設(shè)計(jì),根據(jù)試驗(yàn)號分別考察基本培養(yǎng)基(A)、NAA濃度(B)和6-BA濃度(C)3個因素對莖段和腋芽生長的影響。每個試驗(yàn)號重復(fù)20次,每瓶接種4塊,40 d后統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。計(jì)算公式:腋芽生長系數(shù)=腋芽長度(cm)總和/(接種塊數(shù)-感菌塊數(shù))。因素水平見表1。

        表1 因素水平Tab1 Factors and levels

        2.3 根的誘導(dǎo)

        切取生長的腋芽尖端1.5 cm左右接種在1/2MS+0.5 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上。

        2.4 培養(yǎng)條件

        以上培養(yǎng)溫度均為(25±1)℃,1 500 lx光照12 h·d-1,12 h·d-1黑暗。培養(yǎng)基中均含3%蔗糖、0.65%瓊脂。pH 5.5~5.8。

        3 結(jié)果

        3.1 基本培養(yǎng)基及激素配比對莖段和腋芽生長的影響

        正交試驗(yàn)結(jié)果見表2;方差分析結(jié)果見表3。

        表2、表3結(jié)果表明,影響因素順序是A>C>B。A因素(基本培養(yǎng)基)和C因素(6-BA濃度)對腋芽生長各水平之間具有顯著意義,B因素(NAA濃度)沒有顯著性意義。結(jié)合實(shí)際,最佳培養(yǎng)基組合是A1B1C2,即以MS為基本培養(yǎng)基,添加0.1 mg·L-1NAA和0.5 mg-1L-16-BA,有利于腋芽的萌發(fā)和生長。因A1B1C2在正交表找不到,故應(yīng)作驗(yàn)證試驗(yàn)。

        3.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

        根據(jù)A1B1C2配比配制培養(yǎng)基,其他條件同“2.4”項(xiàng)下,接種20瓶,每瓶接種塊數(shù)4塊,40 d統(tǒng)計(jì)結(jié)果,可得腋芽生長系數(shù)達(dá)10.210,比表2中最高者(字列號1)還高,表明A1B1C2為最佳培養(yǎng)基組合。

        3.3 生根情況

        以1/2MS+0.5 mg·L-1NAA培養(yǎng)基能有效誘導(dǎo)已萌發(fā)腋芽的生根,根的數(shù)量均在10條以上,生長健壯。

        4 討論

        表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab2 Results of orthogonal test

        表3 方差分析結(jié)果Tab3 Results of variance analysis

        筆者考察基本培養(yǎng)基、NAA濃度和6-BA濃度不同配比對粗毛牛膝帶腋芽莖段生長的影響。結(jié)果表明,基本培養(yǎng)基MS、6-BA濃度對腋芽的生長有顯著影響,最佳的培養(yǎng)基組合為MS+0.1 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA,這與文獻(xiàn)[5]對川牛膝的研究結(jié)果一致。通過驗(yàn)證試驗(yàn)可知,在NAA濃度為0.1 mg·L-1時,適當(dāng)增加6-BA的濃度,有利于腋芽的生長。在7號試驗(yàn)中,當(dāng)6-BA達(dá)到1.0 mg·L-1時,腋芽生長系數(shù)明顯降低。說明在一定濃度范圍內(nèi),較高的6-BA/NAA比值有利于芽的分化和生長,這與文獻(xiàn)[6]研究結(jié)果一致:在其他因子不變的情況下,細(xì)胞分裂素所含濃度越高,叢生芽啟動越快,數(shù)量也較多,由此看來細(xì)胞分裂素對誘導(dǎo)粗毛牛膝外植體脫分化有關(guān)鍵作用。本研究中,不定芽在1/2MS+0.5 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上100%生根,且幼根生長健壯,說明粗毛牛膝不定芽誘導(dǎo)生根能力強(qiáng)。本研究結(jié)果可為粗毛牛膝的生物技術(shù)利用提供理論依據(jù)。

        [1]蔡光先.湖南藥物志[M].長沙:湖南科學(xué)技術(shù)出版社,2004:79.

        [2]李明軍,于相麗,陳明霞,等.懷牛膝愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生[J].植物生理學(xué)通訊,2004,40(3):343.

        [3]張麗萍,董誠明,金蓋宇.懷牛膝組織培養(yǎng)及齊墩果酸定量分析的研究[J].河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2003,7(4):32.

        [4]李明軍,李 萍,洪森榮,等.懷牛膝愈傷組織誘導(dǎo)及分化的研究[J].河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,33(4):118.

        [5]劉 堅(jiān),張 挺,陳德茜,等.川牛膝組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究[J].中藥材,2006,29(5):425.

        [6]蔣澤平,梁珍海,李 勁,等.雜交鵝掌楸的離體培養(yǎng)和植株再生研究[J].江蘇林業(yè)科技,2004,31(6):5.

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