李金紅，劉迎九，張國(guó)娟，尹洪超，陶建瓴，李 航

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科，北京 100730

2北京同仁醫(yī)院腎內(nèi)科，北京 100730

3中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病理系，北京 100005

雷帕霉素在臟器移植術(shù)后抗排斥治療［1－6］、腫瘤治療［7］及預(yù)防冠脈支架形成術(shù)后再狹窄［2，8］等方面的有效作用使之已成功地應(yīng)用于臨床。高脂血癥是雷帕霉素最主要的副作用，主要表現(xiàn)為高膽固醇血癥和高三酰甘油血癥［9－11］。雷帕霉素在脂質(zhì)代謝上表現(xiàn)出雙面性:抗動(dòng)脈粥樣硬化和引起高脂血癥這兩個(gè)相矛盾的作用同時(shí)發(fā)生在雷帕霉素用藥過程中。雷帕霉素可通過抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移、減少前炎癥因子的表達(dá)、減少動(dòng)脈單核細(xì)胞趨化因子－1的表達(dá)發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，但雷帕霉素引起高脂血癥的機(jī)制，目前尚不十分清楚。脂肪細(xì)胞的分化成熟及其儲(chǔ)脂功能受人雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin，mTOR)調(diào)控，阻斷mTOR能阻斷脂肪細(xì)胞分化。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator－activated receptor，PPAR) 家 族是動(dòng)物糖脂代謝的主要核調(diào)節(jié)受體，其中PPARγ被認(rèn)為是調(diào)節(jié)脂肪組織分化、抑制ob基因下調(diào)瘦素表達(dá)的主要核受體因子。3T3－L1前脂肪細(xì)胞系是較常用于研究脂肪分化及脂質(zhì)代謝的細(xì)胞模型，它能在胰島素誘導(dǎo)下分化成為成熟的脂肪細(xì)胞，成熟后的3T3－L1具有儲(chǔ)存脂質(zhì)及分泌瘦素、脂聯(lián)素的功能。本研究通過觀察雷帕霉素對(duì)3T3－L1前脂肪細(xì)胞分化、脂質(zhì)蓄積的影響和與PPARγ表達(dá)變化之間的關(guān)系探討雷帕霉素引起高脂血癥的可能機(jī)制。

材料和方法

材料 小鼠3T3－L1前脂肪細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病理系惠贈(zèng)，雷帕霉素由華北制藥廠惠贈(zèng)，膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)物豆甾醇由北京醫(yī)院老年病研究所惠贈(zèng)。胎牛血清、小牛血清和DMEM F12培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司，抗PPARγ抗體購(gòu)自Abcam公司，二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司，瘦素、脂聯(lián)素Elisa試劑盒購(gòu)自R＆D公司，牛胰島素、3－異丁基－l－甲基黃嘌呤和地塞米松購(gòu)自Sigma公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑購(gòu)自TOYOBO公司，引物由上海生物工程有限公司合成。其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

前脂肪細(xì)胞3T3-L1的培養(yǎng) 用含10%小牛血清DMEM F12細(xì)胞培養(yǎng)液在37℃、含5%CO2的孵箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)傳代，3T3－L1前脂肪細(xì)胞的分化采用傳統(tǒng)的雞尾酒法:細(xì)胞培養(yǎng)至融合狀態(tài)2 d后，用10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，再先后用脂肪細(xì)胞分化液Ⅰ (含地塞米松 1 μmol/L、3－異丁基－l－甲基黃嘌呤11 ng/ml、胰島素10μg/ml的10%胎牛血清DMEM F12培養(yǎng)液)、Ⅱ (含胰島素10μg/ml的10%胎牛血清DMEM F12培養(yǎng)液)培養(yǎng)2 d，去除分化液后再用含10%胎牛血清的DMEM F12細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，至其成熟。以加分化液Ⅰ起，標(biāo)記脂肪細(xì)胞為分化0 d，以此類推，分化8 d時(shí)3T3－L1細(xì)胞已基本達(dá)成熟狀態(tài)。

油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴變化 將細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，細(xì)胞培養(yǎng)至分化4 d時(shí)，加入含不同濃度的雷帕霉素 (0、50、100、200 nmol/L)的10% 胎牛血清DMEM F12培養(yǎng)液，每2天換1次含藥物的培養(yǎng)液，分化8 d時(shí)用于做油紅O染色，顯微鏡下觀察、照相。

高效液相色譜分析細(xì)胞內(nèi)膽固醇的變化 分化8 d時(shí)細(xì)胞成熟，用0.1 mol/L NaOH 200 μl反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，平均分成2份，移入2支玻璃安珀內(nèi)，分別用于總膽固醇和游離膽固醇檢測(cè)，按照北京醫(yī)院老年病研究所膽固醇檢測(cè)方法［12］對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，上樣于高效液相色譜儀，進(jìn)樣30 μl，流動(dòng)相為乙腈∶異丙醇 (90∶10)，流速1 ml/min，紫外250 nm檢測(cè)。將標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對(duì)膽固醇/內(nèi)標(biāo)峰面積比進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。樣品/內(nèi)標(biāo)峰面積比代入方程計(jì)算濃度，用蛋白濃度校正，單位為mg/g蛋白。以各組與對(duì)照組膽固醇濃度的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3T3-L1前脂肪細(xì)胞分泌功能的檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)在24孔板中，到分化8 d時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液600 μl，－80℃凍存。按照脂聯(lián)素、瘦素的ELISA試劑盒說明書進(jìn)行樣本處理，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，用630 nm糾正;繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，光密度值/標(biāo)準(zhǔn)濃度光密度值為縱坐標(biāo)，在對(duì)數(shù)坐標(biāo)軸上繪制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出各個(gè)樣品的脂聯(lián)素或瘦素的濃度，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析3T3-L1細(xì)胞PPARγ mRNA的表達(dá) 至分化8 d時(shí)細(xì)胞成熟，收集細(xì)胞提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后做實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，酶激活95℃ 3 min，擴(kuò)增反應(yīng):95℃ 15 s變性，退火60℃ 15 s，延伸72℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列為PPARγ:正 義 鏈 5'－CCCTACCCACTTCCATTCCC－3'反義鏈 5'－CGATATTCACGATCACGGCTT－3';β－actin:正義鏈 5'－CATGTACGTTGCTATCCAGGC－3'，反 義 鏈 5'－CTCCTTAATGTCACGCACGAT－3'。

Western blot方法分析3T3-L1細(xì)胞PPARγ的蛋白表達(dá) 至分化8 d時(shí)細(xì)胞成熟，收集細(xì)胞提取總蛋白30μg進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將電泳分離后蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，經(jīng)封閉后加入PPARγ(1∶500)兔抗鼠多克隆抗體，用 β－actin(1∶1000)抗體做內(nèi)參，4℃孵育過夜，洗膜后用二抗 (1∶4000)室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光法顯影，用Image－Pro Plus圖像分析軟件分析蛋白條帶的積分光密度值 (integrated optical density，IOD)，IOD=平均光密度值×面積，以PPARγ IOD/β－actin IOD的比值反映蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

阻斷或激活PPARγ對(duì)3T3-L1細(xì)胞PPARγ表達(dá)的影響 將細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，細(xì)胞培養(yǎng)至分化4 d時(shí)，分為雷帕霉素100 nmol/L、PPARγ阻斷劑GW966210 μmol/L、PPARγ 增敏劑曲格列酮 (troglitazone，TZD)10 μmol/L處理組，用Western blot方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)PPARγ蛋白和mRNA的表達(dá)，高效液相色譜法定量分析各組膽固醇濃度，ELISA法分析各組上清液中瘦素表達(dá)量變化。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，差異顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

細(xì)胞內(nèi)脂滴變化 雷帕霉素0、50、100、200 nmol/L處理3T3－L1細(xì)胞4 d后做油紅0染色，顯示雷帕霉素在50～200 nmol/L濃度內(nèi)均能抑制3T3－L1細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的形成 (圖1)。

圖1 油紅O染色顯示不同濃度雷帕霉素處理細(xì)胞成熟后蓄積脂滴的變化 (×400)Fig 1 Oil red O staining shows the changes of cholesterol accumulation after treatment with different concentration of rapamycin(×400)

膽固醇含量 對(duì)照組、雷帕霉素50、100、200 nmol/L組細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇含量分別為 (12.89±0.16)、(9.84±0.45)、(9.39±0.46)和(8.61±0.34)mg/ml，與對(duì)照組相比，雷帕霉素50、100、200 nmol/L細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇蓄積減少 (P＜0.05)，細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量分別為 (12.91±0.50)、(9.94±0.96)、(10.45±2.51)和 (9.53±0.63)mg/ml，與對(duì)照組相比，雷帕霉素50、100、200 nmol/L組細(xì)胞內(nèi)總膽固醇蓄積減少 (P＜0.05)，50、200 nmol/L組差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。

瘦素、脂聯(lián)素的分泌 對(duì)照組、雷帕霉素50、100、200 nmol/L組瘦素分泌量分別為 (19.02±0.52)、(16.98±0.11)、(15.62±0.01)、(13.84±0.66)ng/ml，與對(duì)照組相比，雷帕霉素能減少成熟后3T3－L1脂肪細(xì)胞瘦素的分泌水平 (P＜0.05);對(duì)照組、雷帕霉素50、100、200 nmol/L組脂聯(lián)素分泌量分別為 (0.093±0.003)、(0.088±0.031)、(0.078±0.005)、 (0.078±0.016)ng/ml，與對(duì)照組相比，雷帕霉素未影響脂聯(lián)素分泌水平 (P＞0.05)。

PPARγ mRNA的表達(dá) 在作用3T3－L1細(xì)胞96 h后，雷帕霉素50、100及200 nmol/L組PPARγ mRNA表達(dá)量分別為對(duì)照組的 (0.93±0.14)、(0.62±0.10)和 (0.47±0.19)倍，均較對(duì)照組降低 (P＜0.05)，其中200 nmol/L作用最明顯。

PPARγ蛋白的表達(dá) 在作用3T3－L1細(xì)胞96 h后，雷帕霉素50、100及200 nmol/L組PPARγ蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的 (0.80±0.12)、(0.74±0.11)和 (0.61±0.10)倍，均較對(duì)照組降低 (P＜0.05)(圖2)。

圖2 Western blot分析不同濃度雷帕霉素處理組3T3－L1細(xì)胞內(nèi)PPARγ的蛋白表達(dá)Fig 2 Western blot shows the protein expression of PPARγ in 3T3－L1 cells after treatment with different concentrations of rapamycin

阻斷或激活PPARγ對(duì)3T3-L1細(xì)胞PPARγ表達(dá)的影響 雷帕霉素100 nmol/L、PPARγ阻斷劑GW966210 μmol/L、PPARγ 增敏劑 TZD 10 μmol/L 分別處理細(xì)胞96 h，檢測(cè)PPARγ mRNA的表達(dá)，分別為對(duì)照組的(0.60±0.14)、(0.67±0.03)和 (1.30±0.14)倍，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。各處理組PPARγ蛋白表達(dá)與 mRNA的表達(dá)變化趨勢(shì)相似，雷帕霉素 100 nmol/L、PPARγ阻斷劑GW966210 μmol/L、PPARγ 增敏劑 TZD 10 μmol/L處理組細(xì)胞內(nèi)PPARγ蛋白表達(dá)，分別為對(duì)照組的(0.74±0.11)、(0.57±0.23)和 (1.91±0.12)倍，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)(圖 3)。

圖3 Western blot檢測(cè)PPARγ阻斷或激活后蛋白的表達(dá)Fig 3 Western blot shows the PPARγ protein expression after 3T3－L1 is treated with PPARγ agonist or blocking agent

阻斷或激活PPARγ對(duì)3T3-L1細(xì)胞脂質(zhì)蓄積量的影響 對(duì)照組、雷帕霉素100 nmol/L、PPARγ阻斷劑GW966210 μmol/L、PPARγ 增敏劑 TZD 10 μmol/L 分別處理細(xì)胞96 h，高效液相色譜測(cè)定各組總膽固醇量分別為 (12.91±0.50)、(10.45±2.52)、(11.88±0.55)和 (13.27±0.71)mg/ml，游離膽固醇量分別為 (12.89±0.16)、 (9.39±0.46)、 (11.09±0.11)和 (11.83±0.47)mg/ml，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。

阻斷或激活PPARγ對(duì)3T3-L1細(xì)胞分泌瘦素的影響 對(duì)照組、雷帕霉素100 nmol/L、PPARγ阻斷劑 GW966210 μmol/L、PPARγ 增敏劑 TZD 10 μmol/L分別處理細(xì)胞96 h，ELISA檢測(cè)各處理組瘦素表達(dá)量分別為 (19.02±0.52)、(15.62±0.10)、(14.45±1.01)和 (18.07±0.66)ng/ml，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。

討 論

經(jīng)雷帕霉素的Ⅱ期臨床試驗(yàn)驗(yàn)證，雷帕霉素在聯(lián)合環(huán)孢素或者激素類使用時(shí)能發(fā)揮有效的免疫抑制效應(yīng)，而且腎毒性、神經(jīng)毒性小，服用雷帕霉素的患者也不易有糖尿病傾向。然而，高脂血癥是雷帕霉素的嚴(yán)重的副作用，大約40%接受雷帕霉素治療的腎移植患者出現(xiàn)高脂血癥，主要表現(xiàn)為膽固醇、三酰甘油在用藥期間明顯上升，同時(shí)伴有載脂蛋白Apo－B100、ApoC－Ⅲ的升高，高血脂一般在患者用藥2～3個(gè)月后達(dá)頂峰，而且具有劑量和濃度依賴性，當(dāng)患者三酰甘油或膽固醇分別升到0.3或0.2 mg/L時(shí)需要利用藥物進(jìn)行控制［13］。雷帕霉素顯著延遲血液中低密度、中密度、極低密度脂蛋白的清除，還可以加重神經(jīng)鈣調(diào)蛋白抑制劑和類固醇激素誘發(fā)的高三酰甘油血癥，它使慢性腎臟疾病患者的血脂代謝障礙變得更難處理。有關(guān)雷帕霉素引起高脂血癥機(jī)制的研究尚未深入。

脂肪組織是體內(nèi)最大的膽固醇儲(chǔ)存庫(kù)，脂肪組織的數(shù)目以及脂肪細(xì)胞內(nèi)所含的三酰甘油的量決定了細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量［14］。脂肪細(xì)胞內(nèi)膽固醇的平衡又直接影響到整個(gè)機(jī)體的膽固醇穩(wěn)態(tài)［15－16］，在某些病理狀態(tài)下脂肪組織細(xì)胞數(shù)目減少、儲(chǔ)存脂質(zhì)能力降低將造成體內(nèi)血脂含量的上升。脂肪組織合成多種載脂蛋白、脂蛋白受體，也是脂蛋白脂酶合成的主要部位，是血脂代謝調(diào)控的重要樞紐。細(xì)胞水平研究顯示，雷帕霉素能減少原代培養(yǎng)脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量［17］。本研究顯示，雷帕霉素能抑制3T3－L1前脂肪細(xì)胞分化成熟，雷帕霉素處理組細(xì)胞內(nèi)脂滴變小，脂質(zhì)總蓄積量減少;定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積量顯示，游離膽固醇的劑量依賴性地減少，表明雷帕霉素能抑制脂肪細(xì)胞脂質(zhì)蓄積，減少細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇含量。

脂肪組織不僅參與能量、脂質(zhì)代謝，同時(shí)是重要的分泌器官，成熟的脂肪細(xì)胞可以通過自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌的方式分泌瘦素、脂聯(lián)素及抵抗素、腫瘤壞死因子、白介素－6、等重要的脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)因子。瘦素是成熟脂肪細(xì)胞分泌的一種重要激素，通過作用于下丘腦厭食中樞負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)體攝食和能量消耗，促進(jìn)脂肪水解降低體內(nèi)的血脂水平［18］。瘦素水平與空腹胰島素水平及體重指數(shù)正相關(guān)，是1型糖尿病和肥胖的重要生理指標(biāo)之一，其與ApoB/A1比例有明顯相關(guān)性，而后者是腹型肥胖及兒童代謝綜合征的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。瘦素的分泌受磷脂酰肌醇－3激酶信號(hào)途徑和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體－1調(diào)控，而雷帕霉素作為mTOR抑制劑，多數(shù)作用均是通過抑制mTOR及其下游的p70S6K和4EBP1蛋白實(shí)現(xiàn)的。本研究顯示，雷帕霉素能劑量依賴性地抑制瘦素的分泌水平。脂聯(lián)素也是成熟脂肪細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)糖脂代謝的重要激素，脂聯(lián)素的分泌水平不同于脂肪組織分泌的其他激素，肥胖的患者血清脂聯(lián)素水平降低，體重減輕后脂聯(lián)素分泌水平增加。脂聯(lián)素增加內(nèi)臟脂肪組織體積與腹型肥胖相關(guān)，是代謝綜合征的一個(gè)重要分子標(biāo)志物，同時(shí)脂聯(lián)素又有增加胰島素敏感性、抗動(dòng)脈粥樣硬化及抗炎癥的作用。但本研究脂聯(lián)素的表達(dá)水平并未受雷帕霉素的影響，推測(cè)脂聯(lián)素的分泌可能不依賴于mTOR 激酶活性。Blümer等［19］認(rèn)為脂聯(lián)素的分泌受磷脂酰肌醇－3激酶活性及酸性溶酶體pH值調(diào)節(jié)，推測(cè)可能脂聯(lián)素的分泌并不受mTOR信號(hào)通路影響。

PPARγ是脂肪細(xì)胞分化成熟的關(guān)鍵因子，和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 (C/EBP－α)形成正反饋環(huán)激活維持脂肪細(xì)胞功能的各種酶類直到其分化成熟。本研究在用PPARγ阻斷劑GW9662部分阻斷 PPARγ的表達(dá)后，3T3－L1細(xì)胞內(nèi)蓄積的膽固醇、分泌的瘦素量均減少;而用曲格列酮激動(dòng)PPARγ脂質(zhì)的蓄積量和瘦素的表達(dá)均有所上升。表明PPARγ影響3T3－L1前脂肪細(xì)胞分化成熟及分泌功能。雷帕霉素能劑量依賴性地抑制3T3－L1前脂肪細(xì)胞內(nèi)PPARγmRNA和蛋白的表達(dá)且對(duì)3T3－L1前脂肪細(xì)胞的分化成熟和分泌。

功能的影響與GW9662的作用相似，推測(cè)雷帕霉素能通過抑制PPARγ從而減少3T3－L1脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積及瘦素分泌，而脂肪細(xì)胞蓄積脂質(zhì)減少和分泌瘦素減少均能影響體內(nèi)血脂平衡，這也為雷帕霉素引起的高脂血癥提供一個(gè)可能的解釋。

［1］Sehgal SN.Rapamune(RAPA，rapamycin，sirolimus):mechanism of action immunosuppressive effect results from blockade of signal transduction and inhibition of cell cycle progression ［J］.Clin Biochem，1998，31(5):335－340.

［2］Marx SO，Marks AR.Bench to bedside:the development of rapamycin and its application to stent restenosis ［J］.Circulation，2001，104(8):852－855.

［3］Flechner SM，Goldfarb D，Modlin C，et al.Kidney transplantation without calcineurin inhibitor drugs:a prospective，randomized trial of sirolimus versus cyclosporine ［J］.Transplantation，2002，74(8):1070－1076.

［4］Keogh A，Richardson M，Ruygrok P，et al.Sirolimus in de novo heart transplant recipients reduces acute rejection and prevents coronary artery disease at 2 years:a randomized clinical trial ［J］.Circulation，2004，110(17):2694－2700.

［5］Trotter JF，Wachs M，Bak T，et al.Liver transplantation using sirolimus and minimal corticosteroids(3－day taper)［J］.Liver Transpl，2001，7(4):343－351.

［6］Shitrit D，Rahamimov R，Gidon S，et al.Use of sirolimus and low－dose calcineurin inhibitor in lung transplant recipients with renal impairment:results of a controlled pilot study［J］.Kidney Int，2005，67(4):1471－1475.

［7］Guertin DA，Sabatini DM.An expanding role for mTOR in cancer ［J］.Trends Mol Med，2005，11(8):353－361.

［8］Fajadet J，Morice MC，Bode C，et al.Maintenance of longterm clinical benefit with sirolimus－eluting coronary stents:three－year results of the ravel trial［J］.Circulation，2005，111(8):1040－1044.

［9］Almalla M，Schr?der J，Deserno V，et al.Long－term clinical outcome of sirolimus－eluting stent implantation in metabolic syndrome and diabetes ［J］.J Invasive Cardiol，2010，22(7):317－321.

［10］Fernandez－Bussy S，Akindipe O，Baz M，et al.Sirolimusinduced severe hypertriglyceridemia in a lung transplant recipient［J］.Transplantation，2010，89(4):481－482.

［11］Morales JM，Hartmann A，Walker R，et al.Similar lipid profile but improved long－term outcomes with sirolimus after cyclosporine withdrawal compared to sirolimus with continuous cyclosporine ［J］.Transplant Proc，2009，41(6):2339－2344.

［12］劉蕾，周偉燕，孫春華，等.同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定血清總膽固醇 ［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，30(3):250－254.

［13］Morrisett JD，Ghada AF，Ron H，et al.Effects of sirolimus on plasma lipids，lipoprotein levels，and fatty acid metabolism in renal transplant patients［J］.J Lip Res，2002，43(8):1170－1180.

［14］Brown MS，Goldstein JL.The SREBP pathway:regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane－bound transcription factor ［J］.Cell，1997，89(5):331－340.

［15］Dugail I，Le Lay S，Varret M，et al.New insights into how adipocytes sense their triglyceride stores.Is cholesterol a signal［J］?Horm Metab Res，2003，35(4):204－210.

［16］Wu YY，Chiu YS，Chen WY，et al.Long－term administration of rapamycin reduces adiposity，but impairs glucose tolerance in high－fat diet－fed KK/HlJ mice ［J］.Basic Clin Pharmacol Toxicol，2009，105(3):188－198.

［17］Magun R，Gagnon A，Yaraghi Z，et al.Expression and regulation of neuronal apoptosis inhibitory protein during adipocyte differentiation ［J］.Diabetes，1998，47(12):1948－1952.

［18］Minokoshi Y，Shiuchi T，Lee S，et al.Role of hypothalamic AMP－kinase in food intake regulation ［J］.Nutrition，2008，24(9):786－790.

［19］Blümer RM，van Roomen CP，Meijer AJ，et al.Regulation of adiponectin secretion by insulin and amino acids in 3T3－L1 adipocytes［J］.Metabolism，2008，57(12):1655－1662.