王紅梅，洪 靜，羅文利，常建航，姚曉光，李南方

1新疆醫(yī)科大學(xué) 研究生院，烏魯木齊 830054

2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院高血壓診療研究中心 新疆高血壓診療研究中心，烏魯木齊 830001

超重、肥胖是高血壓、糖尿病、冠心病等心血管相關(guān)疾病的重要危險(xiǎn)因素，目前認(rèn)為是由基因和環(huán)境等因素相互作用引起的。研究表明，人體脂肪容量的變異約有40%歸因于遺傳因素［1-2］。神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育調(diào)控樣蛋白4(neural precursor cell expressed developmentally downregulated 4-like，NEDD4L)是泛素-蛋白酶體途徑的重要組成部分，可能參與了肥胖的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程［3-5］。近年來(lái)，一些研究也證實(shí)了NEDD4L的rs3865418多態(tài)性與白人、黑人和中國(guó)漢族人群的高血壓相關(guān)［6-9］。但上述研究還發(fā)現(xiàn)rs3865418多態(tài)性的T等位基因與希臘白人的高血壓發(fā)病相關(guān)，而C等位基因與美國(guó)白人的高血壓發(fā)病相關(guān)，即是所謂的“反轉(zhuǎn)” (flip-flop)現(xiàn)象，提示在一個(gè)人群中是高危致病因素的等位基因，在另一個(gè)人群中反而是保護(hù)性因素［8］。主要居住在新疆牧區(qū)的哈薩克人是肥胖高發(fā)民族［10］;此外，由于該民族極少與外界通婚，至今仍保留有相對(duì)完整的隔離人類遺傳體系，是研究肥胖等多基因復(fù)雜疾病的理想人群。目前，rs3865418多態(tài)性與該民族肥胖的關(guān)聯(lián)研究相關(guān)報(bào)道較少，因此，本研究采用TaqMan PCR法對(duì)該基因的rs3865418多態(tài)性在哈薩克族自然人群中進(jìn)行分型，分析其與哈薩克族肥胖的相關(guān)性，從遺傳學(xué)角度探討肥胖的易感機(jī)制，以期為肥胖的防治提供參考依據(jù)。

對(duì)象和方法

對(duì)象 采用多級(jí)隨機(jī)抽樣的方法，對(duì)阜康地區(qū)有本地正式戶口、30～60歲、三代內(nèi)無(wú)異族通婚史的長(zhǎng)住哈薩克族居民進(jìn)行流行病學(xué)現(xiàn)況調(diào)查。調(diào)查前事先登記人口，保證應(yīng)答率，保證入選個(gè)體均為無(wú)關(guān)個(gè)體，最后共有856例 (男性364例、女性492例)入選本研究。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。本研究通過(guò)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查并同意實(shí)施。

方法 以自然人群橫斷面流行病學(xué)調(diào)查為基礎(chǔ)的病例-對(duì)照研究。采用問(wèn)卷調(diào)查方法，調(diào)查工作主要由經(jīng)過(guò)統(tǒng)一培訓(xùn)的、精通哈薩克薩克語(yǔ)的專職人員填寫表格、詢問(wèn)病史、體格檢查。所有研究對(duì)象均收集一般資料，包括性別、年齡、腰圍、收縮壓、舒張壓等。每位研究對(duì)象均抽取空腹?fàn)顟B(tài)下全血5 ml，現(xiàn)場(chǎng)離心分離血清和血液有形成份，血清在采血后1個(gè)月內(nèi)檢測(cè)血脂等生化指標(biāo)，血液有形成份在－80℃保存，以提取DNA。生化檢測(cè)均在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院 (三級(jí)甲等醫(yī)院)檢驗(yàn)科完成并由專人負(fù)責(zé)。按《中國(guó)成人超重和肥胖癥預(yù)防控制指南》［11］標(biāo)準(zhǔn)診斷中心性肥胖，即男性腰圍≥85 cm、女性腰圍≥80 cm者為中心性肥胖，按此標(biāo)準(zhǔn)，856例研究對(duì)象中肥胖組共478例、對(duì)照組共378例。

哈薩克族人外周血基因組DNA提取 采用PAXgene Blood DNA試劑盒 (QIAGEN，Hilden，Germany)，并按照試劑盒中提供的“操作說(shuō)明”中的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟提取研究對(duì)象的外周血基因組DNA。

哈薩克族人群中基因分型 采用Taqman PCR技術(shù)，使用 ABI 7900HT(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，California，USA)對(duì)856例研究對(duì)象進(jìn)行基因分型。PCR的反應(yīng)體系:總體積25 μl，其中人類Taq-Man基因多態(tài)性分型預(yù)混液 (Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，California，USA)12.5 μl、單核苷酸多態(tài)性分型探針/引物預(yù)混液 (Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，California，USA)1.25 μl、DNA 模板 (20 ng/μl)2 μl、去離子水 9.25 μl。反應(yīng)條件:預(yù)變性 (95℃、10 min、1個(gè)循環(huán))，變性 (92℃、15 s)+退火 (60℃、1 min)+延伸 (72℃、1 min)43個(gè)循環(huán)，總延伸(72℃、7 min、1個(gè)循環(huán))。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0(SPSS Inc.，Chicago，Illinois，USA)統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示。組間臨床表型計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn) (兩組間)或單因素方差分析 (三組間)，分類資料采用卡方檢驗(yàn)。由基因型頻率計(jì)算等位基因頻率，Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)、兩組間等位基因頻率和基因型頻率比較采用專業(yè)的遺傳學(xué)分析軟件SNPAlyze Ver.7.0.1 pro(日本)進(jìn)行分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

基因分型 對(duì)rs3865418多態(tài)性在851例哈薩克族自然人群中成功進(jìn)行了基因分型，另有5例分型未成功，基因分型的讀取率99.4%，重復(fù)檢測(cè)一致率100%。肥胖組、對(duì)照組的基因型、等位基因頻率分布均符合 Hardy-Weinberg平衡 (肥胖組 χ2=0.743，P=0.389;對(duì)照組 χ2=0.173，P=0.967)。

臨床特征 與對(duì)照組比較，肥胖組的平均年齡、收縮壓、舒張壓、腰圍、總膽固醇、三酰甘油水平增高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);但兩組間吸煙、飲酒者比例的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)(表1)。

rs3865418多態(tài)性與哈薩克族人肥胖的相關(guān)性

在總體、男性、女性哈薩克族自然人群中，rs3865418多態(tài)性的基因型 (包括累加模型、顯性模型和隱性模型)、等位基因在肥胖組及對(duì)照組分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)(表2)。在總體哈薩克族自然人群中，C/C、C/T、T/T 3種基因型攜帶者的腰圍差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);男性腰圍平均水平有C/C攜帶者＞C/T攜帶者＞T/T攜帶者的趨勢(shì)，而女性腰圍平均水平有C/C攜帶者＜C/T攜帶者＜T/T攜帶者的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)(表3)。

表1 肥胖組及對(duì)照組臨床資料比較Table 1 Basic characteristics of subjects in obesity group and normal control group

表2 rs3865418多態(tài)性基因型、等位基因在肥胖組及對(duì)照組間分布頻率 (n)Table 2 Genotype and allele distributions of rs3865418 polymorphism in obesity group and normal control group(n)

表3 不同基因型腰圍的比較 (，cm)Table 3 Comparing of waist circumference between different genotypes(，cm)

表3 不同基因型腰圍的比較 (，cm)Table 3 Comparing of waist circumference between different genotypes(，cm)

基因型Genotypes 總體Total 男性Male 女性Female C/C 84.09±11.619 88.54±11.775 80.39±10.119 C/T 83.54±12.425 87.51±12.615 80.72±11.510 T/T 84.78±12.581 86.19±12.308 83.89±12.743 P 0.572 0.471 0.050

討 論

泛素-蛋白酶體途徑是真核生物內(nèi)主要的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng) (70%～80%)。除此之外，該系統(tǒng)也介導(dǎo)、調(diào)節(jié)核因子κB的激活過(guò)程［3］。核因子κB是重要的炎性轉(zhuǎn)錄因子并控制白介素-6、白介素-8、腫瘤壞死因子-a等炎性細(xì)胞因子及一些黏附因子的轉(zhuǎn)錄過(guò)程［4］。研究表明非特異性系統(tǒng)性炎癥在肥胖的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［5］。因此，泛素-蛋白酶體途徑可能參與肥胖的發(fā)病過(guò)程。除泛素外，泛素-蛋白酶體途徑還包括4種酶家族:泛素活化酶、泛素結(jié)合酶、泛素蛋白連接酶及蛋白酶體，它們均以多種異構(gòu)體形式存在。NEDD4L是泛素蛋白連接酶家族成員，故從其生理功能角度來(lái)看，NEDD4L是肥胖的候選基因。

本研究證實(shí)rs3865418多態(tài)性可能與新疆哈薩克族自然人群中心性肥胖不相關(guān)。但是本研究這個(gè)陰性研究結(jié)果并不是因?yàn)闄z驗(yàn)效能不足所導(dǎo)致的 (本研究檢驗(yàn)效能為0.962)。此外，關(guān)聯(lián)研究中的假陰性結(jié)論的主要原因是受混雜因素的干擾。在諸多混雜因素中，一個(gè)極其重要但又常被忽視的因素即是群體的遺傳分層現(xiàn)象，這往往由于遺傳背景不一的亞人群混合所致，其產(chǎn)生機(jī)制復(fù)雜，可能與各亞人群祖先的遷移模式、婚配習(xí)慣、生殖強(qiáng)弱及基因組的隨機(jī)突變等因素有關(guān)。群體分層對(duì)遺傳關(guān)聯(lián)分析的直接影響是可能導(dǎo)致結(jié)果偏倚，產(chǎn)生假陰性的結(jié)果。正因如此，很多關(guān)聯(lián)研究的結(jié)果難以在不同人群的研究中得到重復(fù)。因此在進(jìn)行病例對(duì)照的關(guān)聯(lián)研究時(shí)，盡可能排除群體分層的干擾尤為重要，如加大樣本量并盡可能的選擇一個(gè)遺傳上相對(duì)均質(zhì)的群體等。本研究樣本均來(lái)自于一個(gè)遺傳上相對(duì)均質(zhì)的相對(duì)隔離群體，研究樣本量較大，而且該人群中rs3865418多態(tài)性的基因型、等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡，因此本研究結(jié)論是相對(duì)可信的。但在今后的研究中尚需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量及在其他民族人群中驗(yàn)證。

本研究雖然未顯示rs3865418多態(tài)性與哈薩克族人群肥胖相關(guān)，但是顯示男性腰圍平均水平有C/C攜帶者＞C/T攜帶者＞T/T攜帶者的趨勢(shì)，而女性腰圍平均水平有C/C攜帶者＜C/T攜帶者＜T/T攜帶者的趨勢(shì)，盡管上述差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但也提示在新疆哈薩克族人群中rs3865418多態(tài)性可能存在不同性別間的“反轉(zhuǎn)” (flip-flop)現(xiàn)象，因此尚需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。既往的研究發(fā)現(xiàn)NEDD4L的rs3865418多態(tài)性與高血壓的關(guān)聯(lián)存在“反轉(zhuǎn)”(flip-flop)現(xiàn)象［6-9］，即在一個(gè)人群中是高危致病因素的等位基因，在另一個(gè)人群中反而是保護(hù)性因素［8］。分析其原因可能是 rs3865418多態(tài)性變異位于NEDD4L的內(nèi)含子區(qū)，因其并未引起編碼氨基酸的改變而不是傳統(tǒng)意義上的“致病突變”，故其與疾病是否相關(guān)可能是取決于該變異是否與其他與疾病相關(guān)的功能性變異間存在連鎖不平衡:即在某一人群中當(dāng)其T等位基因與致病變異連鎖時(shí)，可以表現(xiàn)為致病因素;當(dāng)與保護(hù)性變異連鎖時(shí)，表現(xiàn)為保護(hù)性因素;當(dāng)與功能性變異不連鎖時(shí)，表現(xiàn)為與疾病不相關(guān);因此尚需要進(jìn)一步深入研究位于此位點(diǎn)周圍的、可能與其存在連鎖不平衡關(guān)系的NEDD4L變異及周圍其他基因的變異與疾病的關(guān)系。

綜上，本研究通過(guò)探討NEDD4L變異與哈薩克族人群肥胖的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)rs3865418多態(tài)性可能與哈薩克族人群肥胖不相關(guān)。在此后的研究中，尚需擴(kuò)大樣本量及在其他民族人群中驗(yàn)證，并且此位點(diǎn)周圍的其他的NEDD4L變異及周圍其他基因的變異與肥胖的關(guān)系尚需要進(jìn)一步研究。

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