潘曉蔚 顏紅軍

（1 沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)中心實驗室，遼寧 沈陽 110034；2 沈陽醫(yī)學(xué)院沈洲醫(yī)院，遼寧 沈陽 110002）

近年來，在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)及臨床研究中，分子生物學(xué)技術(shù)越來越廣泛的被應(yīng)用其中，但在研究過程中，研究者常常會遇到些實際問題，擴增成功率低，一般是由于在較短時間內(nèi)無法獲得多個病例的新鮮標本，從而使研究的準確性無法進一步提高[1]?，F(xiàn)如今，國內(nèi)外的一些研究機構(gòu)報告，用石蠟包埋組織，經(jīng)過一系列的操作后提取DNA，用于PCR擴增和進一步分子診斷。PCR擴增能否成功取決于DNA聚合酶活性、引物設(shè)計等很多因素，PCR反應(yīng)混合物中大部分是成品，所以，以現(xiàn)有的條件，采用何種方法能夠獲得模板DNA與PCR相匹配，引物設(shè)計是否合理都是成功提取DNA的關(guān)鍵所在。因此，從石蠟包埋組織中提取DNA成為當即臨床上常用的技術(shù)手段[2]。本文中我們就從石蠟包埋組織中提取DNA的方法進行探討，現(xiàn)將具體結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2010年10月至2011年4月于沈陽醫(yī)學(xué)院沈洲醫(yī)院采集的160例活檢組織標本，膀胱癌36例，淋巴瘤48例，胃癌46例，宮頸癌22例，胃炎8例。標本均經(jīng)復(fù)查符合病理診斷。固定石蠟包埋材料，將上述標本均經(jīng)福爾馬林固定，室溫保存。其他材料還有二甲苯、DNA提取試劑盒、乙醇、恒溫水浴箱、低溫離心機、無菌布墊、切片機和震蕩混合機、蛋白酶K。

1.2 方法

在消毒后的離心小管內(nèi)放入厚約5～10μm的組織切片。每切一次后更換切片刀位置，以免交叉感染。在紗布墊上噴入新稀釋的漂白液（一般濃度為10%），將切片機清潔干凈，用乙醇沖洗。然后進行脫蠟、水化：①在離心管內(nèi)放入組織進行離心5s，轉(zhuǎn)速為2000/s，等組織沉入管底。②用干凈紗布將離心管蓋包住，輕輕打開離心管蓋，切忌觸摸蓋子內(nèi)側(cè)，避免樣品被污染。③在每個管內(nèi)分別加入l mL二甲苯，然后在37℃水浴箱內(nèi)進行1h水浴，以12000轉(zhuǎn)/分的速度離心5min，取下液(重復(fù)4次)。④在離心管內(nèi)分別加100%乙醇1mL、95%乙醇1mL及75%乙醇l mL，將每個小管混勻，每次以12000轉(zhuǎn)/分速度離心1min，取下液，在37～40℃室溫下吸干或略微烘干。在55℃恒溫箱內(nèi)放入離心小管30min進行干燥。⑤組織轉(zhuǎn)變?yōu)榘咨虘B(tài)。拿離心管時要防止因靜電作用而使干燥組織彈出管外。⑥干燥組織時，打開離心管，應(yīng)避免各離心管接觸，以防樣品之間交叉污染。⑦加緩沖液GA2O0uL進行振蕩，直至徹底懸浮時，然后加入RNaseA溶液(25mg/mL)振蕩15s，在37℃水浴箱中放置30min。⑧取出后，加入約20uL的蛋白酶K，混勻后，在55℃水浴箱中過夜，在此期間，應(yīng)將樣品每小時顛倒混勻2～3次，動作宜輕柔，以免DNA堿基對被打斷。然后提取DNA。

1.3 評價標準

對石蠟包埋組織中提取出DNA的成功率進行評價，成功率=成功例數(shù)/受檢例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

將文中統(tǒng)計所得數(shù)據(jù)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS12.0進行相關(guān)處理，計量資料進行t檢驗，計數(shù)資料進行χ2檢驗，P＜0.01或P＜0.05表示有非常顯著性差異或有顯著性差異。

2 結(jié) 果

將從石蠟包埋組織中提取出DNA情況進行統(tǒng)計及比較，具體結(jié)果見表1。

表1 從石蠟包埋組織中提取DNA情況

3 討 論

臨床上最方便的材料來源是石蠟包埋組織，很多大病例的回顧性研究中經(jīng)常用到。由此可見，以石蠟包埋組織為材料，進行提取DNA進行基因檢測或疾病診斷已廣泛應(yīng)用于臨床[3]。對于各種基因分析而言，要想獲得更加準確的檢測結(jié)果，就必須獲得足夠數(shù)量和純度的DNA，來滿足PCR要求進行分析。理論上講，從石蠟包埋組織中提取DNA用于PCR擴增的方法比較簡單，但在實際操作中卻有著相當?shù)碾y度。必須先將組織切片中的石蠟溶解，然后對組織進行處理，釋放出DNA。在實驗的每個過程中都必須嚴格操作，以免提取的DNA純度及數(shù)量有出入，對下一實驗過程造成不必要的影響[4]。臨床上可以檢測出DNA的標本有很多種，但是標本的類型和來源也可早成檢測結(jié)果的不同，所以，新鮮組織是檢測DNA的最佳標本，而實際工作中，獲取新鮮組織的是有一定難度的，脫蠟的方法也是值得注意的。正確的脫蠟方法可以增加DNA的濃度、純度以及完整性[5]。

在操作過程中，有幾點需要操作者注意：①石蠟切片的厚度會對DNA的質(zhì)量造成影響。在本試驗中，未能成功提取DNA的6例中，有3例是切片厚度為2.6μm，1例為5μm。由此可見，切片的厚度為10μm時提取的DNA質(zhì)量更高。②組織切片的脫蠟時間對DNA提取質(zhì)量的影響。在PCR反應(yīng)中，石蠟具有較大的影響，因此，脫蠟過程必須嚴格執(zhí)行，徹底脫蠟可以保證實驗下一步驟的順利進行。③此外，還有蛋白酶K的濃度和組織消化時間。蛋白酶K的濃度越大，組織消化所需時間就越長，提取的DNA數(shù)量就越多，但PCR中DNA量減少，蛋白酶K的濃度以0.5g/L為宜，組織消化時間應(yīng)掌握在12h左右。④其他情況對提取DNA質(zhì)量的影響。壞死組織釋放出各種酶，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和DNA降解，影響實驗結(jié)果。所以應(yīng)先將壞死組織剔除。核酸酶對DNA有較強的降解作用，應(yīng)在消化蛋白酶K前將核酸酶滅活，以增加DNA產(chǎn)量。將石蠟包埋組織中提取出的DNA在PCR反應(yīng)模板進行擴增時應(yīng)減少模板數(shù)量，加大反應(yīng)循環(huán)次數(shù)，一般在40次以上，促進PCR擴增成功數(shù)[6]。本文中我們就從石蠟包埋組織中提取DNA的方法進行探討，發(fā)現(xiàn)從石蠟包埋組織中提取DNA成功例數(shù)高于失敗例數(shù)，P＜0.05，有顯著性差異。因此我們認為從石蠟組織中提取DNA是一種高效、方便的方法，值得在DNA提取中廣泛。

[1]沈望珍,趙學(xué)信,王麗容,等.從石蠟包埋的組織中提取DNA的研究[J].新疆醫(yī)學(xué)院學(xué)報,1995,18(3):144-146.

[2]Du J,Guliziya K,Haimiti A.Further study on the quality of DNA extracted from formalin fi xed and paraff i n embedded tissues[J].J Xinjiang Med Uni,2008,31(9):1146-1147.

[3]Zhang HD,Ren H,Wang XN,et al.A method for rapid DNA extraction from formalin.fixed paraffin-embedded tissue[J].J Clin Exp Pathol,2010,26(5):590-593.

[4]王丹妹,莫燕娜,吉麗敏,等.淺談從石蠟包埋組織中提取DNA的方法及體會[J].衛(wèi)生職業(yè)教育,2008,26(3):119-120.

[5]Zhang X,Tu QH,Chen P,et al.Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded lymphoma tissues and quantitation of the EpsteineBarr virus[J].Clin Edu Nneral Pract,2006,4(1):22-25.

[6]蓋寶東,房學(xué)東,金仲田,等.提高石蠟包埋組織中提取DNA質(zhì)量的實驗研究[J].吉林大學(xué)學(xué)報,2003,29(1):115-118.