呂正光 劉 莉 劉新友 王建偉

（1 92919部隊(duì)醫(yī)院，浙江 寧波 315020；2 第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部藥理教研室，陜西 西安 710032；3 第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710038；4 空軍大連航空醫(yī)學(xué)鑒定訓(xùn)練中心，遼寧 大連 116013）

巨噬細(xì)胞甘露糖受體（Macrophage mannose receptor，MMR）是存在于巨噬細(xì)胞膜表面的一種跨膜蛋白，屬C型凝集素受體家庭成員，相對(duì)分子質(zhì)量為180×103，可特異性的識(shí)別以甘露糖、N-乙酰葡糖胺或巖藻糖為末端的配體并與之結(jié)合[1]，介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的吞噬活動(dòng)，啟動(dòng)免疫反應(yīng)。近年來(lái)，圍繞甘露糖受體在免疫調(diào)節(jié)中作用的研究越來(lái)越多，其中必然要涉及到的問(wèn)題，就是如何檢測(cè)MR與其配體的結(jié)合情況。國(guó)外傳統(tǒng)方法中一般采用放射性配體-受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)輔以熒光顯微鏡檢測(cè)，然而很多實(shí)驗(yàn)室都不具有做放射性實(shí)驗(yàn)的條件，而且也存在一定的風(fēng)險(xiǎn)性；而熒光顯微鏡檢測(cè)并不是一個(gè)很好的定量指標(biāo)，只能半定量。因此，如何尋找一種簡(jiǎn)單、有效的檢測(cè)MR與配體結(jié)合情況的方法，是當(dāng)前國(guó)內(nèi)學(xué)者急待解決的一個(gè)問(wèn)題。我們采用流式細(xì)胞儀輔以熒光顯微鏡對(duì)MR與配體的結(jié)合的情進(jìn)行檢測(cè)，降低了操作的危險(xiǎn)性，不但數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，而且具有操作簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

200～220 g的雌性SD大鼠，由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK（軍）2002-005，動(dòng)物飼養(yǎng)于空調(diào)溫室內(nèi)，溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度50%～60%，自動(dòng)調(diào)控晝夜各12h，顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品和主要儀器

D-甘露糖購(gòu)于上海試劑二廠；ConA，α-淀粉酶，以及異硫氰酸熒光素標(biāo)記的甘露糖化牛血清白蛋白（M-FITC-BSA）購(gòu)于Sigma公司；魔芋精粉購(gòu)于襄樊惠葡生化科技工程有限公司；Beckman Coulter流式細(xì)胞儀；Nikon Eclipse E1000熒光顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 魔芋葡甘露聚糖的提取和純化 （參照文獻(xiàn)）

1.2.1.1 粗提純

魔芋精粉（10g）→50mL石油醚→70～75℃加熱回流0.5h→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)棄石油醚→50mL 90%乙醇→75～80℃加熱回流0.5h→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)棄去乙醇→60℃干燥→粗魔芋葡甘露聚糖。

1.2.1.2 純化

粗魔芋葡甘露聚糖（1g）→配成2%溶膠→酶解（加α-淀粉酶，80℃酶解30min） →0.65μm針孔濾器抽濾→95%乙醇沉淀→85%50℃洗滌30min→5000轉(zhuǎn)/分，4℃，5′→棄上清，溶于水→負(fù)壓抽濾，收集濾液→多糖柱層析→苯酚硫酸法檢測(cè)，收集多糖→透析→冷凍干燥→得純化的魔芋葡甘露聚糖粉。

1.2.2 腹腔巨噬細(xì)胞的分離

取6只雌性昆明鼠，用乙醚麻醉法處死，75%酒精浸泡1min，立即取出，消毒腹部皮膚，打開腹壁，但勿傷及腹膜，向腹腔內(nèi)注入PBS5mL，輕揉腹腔5min，用注射器伸入腹腔，抽取腹腔內(nèi)液體，注入離心管。

1.2.3 腹腔巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)和純化

收集腹腔沖洗液，1000轉(zhuǎn)/分離心5min，棄上清，加入6mL 10%小牛血清培養(yǎng)基，吹打混勻后計(jì)數(shù)，接種腹腔巨噬細(xì)胞5孔于六孔培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)5×105，置37℃ CO2孵箱中培養(yǎng)。3h后輕輕吸棄培養(yǎng)液后，再用PRMI1640培養(yǎng)液洗去未貼壁細(xì)胞，重復(fù)3次，每孔加入10%的小牛血清1.5mL，得純化的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞五組。

1.2.4 巨噬細(xì)胞的鑒定

取1×106腹腔巨噬細(xì)胞接種于底部覆有載玻片的培養(yǎng)皿，同上純化后取出載玻片，做非特異性酯酶染色。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組及M-FITC-BSA標(biāo)記

將所培養(yǎng)的腹腔巨噬細(xì)胞分為五組：①空白對(duì)照組（Control），加入1.5mL 50%PRIM/PBS緩沖液；②陽(yáng)性對(duì)照組，加入用50%PRIM/PBS配制的1mg/mL的M-FITC-BSA 50μL，再加1.5mL緩沖液；③D-甘露糖組，加入用50%PRIM/PBS 配制的0.25mmol/L的D-甘露糖1.5ml，使其終濃度為0.125mmol/L，再加50μL M-FITC-BSA；④低濃度葡甘露聚糖組，加入用50%PRIM/PBS 配制的0.6mg/mL的魔芋葡甘露聚糖1.5mL，使其終濃度為0.3mg/mL，再加50μL M-FITC-BSA；⑤中濃度葡甘露聚糖組，加入用50%PRIM/PBS 配制的1.2mg/mL的魔芋葡甘露聚糖1.5mL，使其終濃度為0.6mg/mL，再加50μL M-FITCBSA；⑥高濃度葡甘露聚糖組，加入用50%PRIM/PBS 配制的2.4mg/mL的魔芋葡甘露聚糖1.5mL，使其終濃度為1.2mg/mL，再加50μL M-FITC-BSA；⑦ConA組，加入用50%PRIM/PBS 配制的6μg/mL的ConA 1.5mL，使其終濃度為3μg/mL，再加50μL M-FITC-BSA。用錫鉑紙包嚴(yán)培養(yǎng)板，置37℃ CO2孵箱中孵育30min。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢查

消化細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管，1000轉(zhuǎn)/分離心5min，棄上清后用PBS洗滌兩遍，每組樣品加0.35mL的PBS并轉(zhuǎn)到檢樣管中，流式檢測(cè)FITC標(biāo)記的細(xì)胞在總體細(xì)胞中所占的百分率。

1.2.7 熒光顯微鏡觀察

同上分離腹腔、肺巨噬細(xì)胞，分別接種同等量的四組細(xì)胞于兩塊底部覆有蓋玻片的六孔培養(yǎng)板，純化后分為陽(yáng)性對(duì)照組、D-甘露糖組、葡甘露聚糖組、ConA組及進(jìn)行M-FITC-BSA標(biāo)記，避光孵育30min后用PBS沖洗接種有巨噬細(xì)胞的蓋玻片兩遍，晾干后滴上50%的甘油PBS 20μL，指甲油封邊，4℃短時(shí)儲(chǔ)存留待觀察。觀察時(shí)激發(fā)濾光片用B-2A，激發(fā)光譜450-490nm，BA520阻擋濾光片，DM505二向分色濾光片。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 巨噬細(xì)胞的鑒定結(jié)果

生長(zhǎng)中的巨噬細(xì)胞呈梭形或多角形，細(xì)胞體積較大且大小不等，生長(zhǎng)過(guò)程中常連接成線狀或網(wǎng)狀。非特異性酯酶染色后，可見陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)沉淀物，定位于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性率高達(dá)99%以上，此現(xiàn)象可被NaF抑制，說(shuō)明培養(yǎng)的細(xì)胞是巨噬細(xì)胞（圖1）。

圖1 非特異性酯酶染色×400

2.2 熒光顯微鏡

腹腔巨噬細(xì)胞膜上的甘露糖受體可與含有甘露糖殘基的M-FITCBSA結(jié)合，處理組中分別加入D-甘露糖、不同濃度的葡甘露聚糖、ConA，熒光顯微鏡檢測(cè)巨噬細(xì)胞熒光染色陽(yáng)性率以比較不同處理因素對(duì)MR與配體親和力的影響。熒光顯微鏡示腹腔巨噬細(xì)胞熒光染色陽(yáng)性率D-甘露糖組、不同濃度葡甘露聚糖組、ConA組與各自的陽(yáng)性對(duì)照組相比有明顯減少，且中、高濃度葡甘露聚糖組的熒光染色陽(yáng)性率要小于D-甘露糖組、低濃度葡甘露聚糖組和ConA組（圖2）。

圖2 腹腔巨噬細(xì)胞熒光顯微鏡(×200)

2.3 流式細(xì)胞儀

通過(guò)流式檢測(cè)FITC標(biāo)記的細(xì)胞在總體細(xì)胞中所占的百分率，示D-甘露糖、不同濃度葡甘露聚糖、ConA對(duì)MR與配體的結(jié)合有明顯的抑制作用，且中、高濃度葡甘露聚糖對(duì)MR與配體的抑制作用強(qiáng)于D-甘露糖、中濃度葡甘露聚糖和ConA，與熒光顯微鏡的結(jié)果一致（圖3）。

圖3 腹腔巨噬細(xì)胞熒光染色的陽(yáng)性率比較(%) (±s，n=6)各組與D-甘露糖組相比，P＜0.01；c、d組與a、b、e組相比，P＜0.01；c組與d組相比，P＞0.05

3 討 論

甘露糖受體作為一種模式識(shí)別受體，可特異地識(shí)別以甘露糖、N-乙酰葡糖胺或巖藻糖為末端的配體并與之結(jié)合。這些糖類在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的糖鏈末端很少出現(xiàn)，但卻經(jīng)常出現(xiàn)于微生物的表面[2]。MR通過(guò)識(shí)別、結(jié)合這些糖類以介導(dǎo)吞噬病原微生物。此外，近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)，MR在結(jié)核、腫瘤、感染等許多疾病中都發(fā)揮著重要作用[3]，是一個(gè)研究的熱點(diǎn)。

植物多糖，尤其是中藥多糖，由于其在免疫調(diào)節(jié)方面的作用，愈來(lái)愈受到了重視。在我國(guó)，已有100多種來(lái)源于中藥的多糖相繼被報(bào)道，大多數(shù)的多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用，其作用機(jī)制涉及T、B、MΦ、NK及細(xì)胞因子等[4]。MR的配體需要甘露糖或巖藻糖殘基，細(xì)菌來(lái)源的甘露聚糖是目前已知的MR親和力最高的配體[5]。含有甘露糖或巖藻糖的中藥多糖可能與MR具有潛在的親合力，可能成為MR的配體。如果中藥來(lái)源的甘露聚糖能與MR結(jié)合，即可得到高親和力、高內(nèi)在活性的中藥多糖，用于提高機(jī)體免疫；或無(wú)/低內(nèi)在活性的中藥多糖，作為受體拮抗劑/部分激動(dòng)劑用于自身免疫性疾??；或作為MR的靶向給藥載體治療HIV及癌癥。

本實(shí)驗(yàn)中先采用熒光顯微鏡對(duì)MR與配體的結(jié)合情況進(jìn)行了觀察，再通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)MR與配體的結(jié)合進(jìn)行了準(zhǔn)確的定量，建立了一種簡(jiǎn)便、可靠的檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)中還檢測(cè)了從魔芋粉中提純的魔芋葡甘露聚糖片段與MR的親和力，發(fā)現(xiàn)其親和力要強(qiáng)于甘露糖ConA，且魔芋葡甘露聚糖片段與配體的親和力存在濃度依賴性。

本實(shí)驗(yàn)表明，魔芋葡甘露聚糖可以與MR結(jié)合，作為MR的候選配體，且有較高的親和力，提示魔芋葡甘露聚糖可能以MR作為靶點(diǎn)，用于MR相關(guān)性的感染、腫瘤、結(jié)核等疾病的治療，提高免疫力。但該多糖片段的構(gòu)效關(guān)系如何，以及其在體的藥效怎樣，均有待于進(jìn)一步研究。

[1]Drickamer K.Ca21-dependent sugar recognition by animal lectins[J].Biochem Soc Trans,1996,24(2): 146–149.

[2]Ashwell G,Harford J.Carbohydrate-specific receptor of the liver[J].Annu Rev Biochem,1982,51: 531–554.

[3]Fraser IP,Henery K,R.Alan BE.The serum mannose-binding protein and the macrophage mannose receptor are pattern recognition molecules that link innate and adaptive immunity [J].Immunology,1998,10(5): 363-372.

[4]聶偉,張永祥.多糖的免疫調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),1999,15(6):484-487.

[5]Diebold SS,Plank C,Cotten M,et al.Mannose receptor-mediated gene delivery into antigen presenting dendritic cells[J].Somat Cell Mol Genet,2002,27(1/6):65-74.