劉 剛， 關(guān)英華， 于江華， 王曉彬， 張明星， 竇中嶺， 梁 豪

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系統(tǒng)腫瘤的常見病，發(fā)病率居第二位，僅次于膀胱癌，近年來，腎癌的發(fā)病率有上升趨勢，據(jù)美國文獻報道，自 1970年來，腎細胞癌發(fā)病率為 2.3% ～4.3%，且呈逐年遞增趨勢，導(dǎo)致每年有超過35 000例新增患者和12 000的死亡人數(shù)［1-2］，其中有60%的腎癌是偶然發(fā)現(xiàn)的［3］，而這些偶發(fā)癌大部分具有小腎癌和不易發(fā)生轉(zhuǎn)移的特點［4］。

腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是一個多因素、多階段、長期相互作用的過程，與DNA損傷程度以及修復(fù)能力密切相關(guān)。人體的DNA長期暴露在理化因素的環(huán)境中(電離輻射和化學(xué)物質(zhì))以及異常代謝產(chǎn)物中(氧自由基)而遭受襲擊，引起DNA化學(xué)結(jié)構(gòu)及其編碼特性的改變而致DNA損傷，這些損傷如果不能得到及時有效的修復(fù)，細胞的正?；顒泳蜁艿狡茐模⒂纱苏T發(fā)一系列的遺傳疾病乃至腫瘤的發(fā)生。DNA損傷修復(fù)是機體對DNA損傷所產(chǎn)生的重要生物學(xué)反應(yīng)，其通過各種不同的損傷修復(fù)通路對DNA序列中損傷的、錯配的或不合適的堿基進行修復(fù)，以保證基因遺傳的穩(wěn)定性［5］。

O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA-methyltransferase，MGMT)是自然界中各種生物體內(nèi)普遍存在的一種獨特DNA修復(fù)酶。人類 MGMT基因定位于10 q26，為單肽結(jié)構(gòu)，其cDNA長約769 bp，編碼207個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，含有5個外顯子和4個內(nèi)含子，第4外顯子中的半胱氨酸殘基為烷基受體，是蛋白酶的活性部位。人MGMT基因穩(wěn)定地存在于所有正常組織細胞內(nèi)，多在具有分裂增殖能力的正常及癌變的胃、結(jié)腸靠近管腔側(cè)腺上皮細胞核內(nèi)，研究結(jié)果提示其主要分布于活性基團轉(zhuǎn)錄的部位。MGMT是一種DNA修復(fù)酶，其主要作用是保護DNA免受烷化劑的損傷，從而阻止腫瘤的發(fā)生，而且有研究表明許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展與MGMT缺失與突變關(guān)系密切［6-7］。

MGMT表達缺失或活性降低是否與腎細胞癌的發(fā)生發(fā)展機制有關(guān)，國內(nèi)外報道甚少。因此，本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測80例腎細胞癌組織和30例癌旁組織及20例正常腎組織中MGMT的表達，探討MGMT表達的異常與腎細胞癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料來源 選取河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科2009年1月—2011年1月間診斷明確的腎細胞癌手術(shù)切除標本80例，癌旁組織30例，另在河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院取正常腎組織20例。腎細胞癌患者中男62例，女18例，年齡35～80歲，平均63.3歲;腎細胞癌分期按2002年TNM分期系統(tǒng)(AJCC):T1+T262例、T3+T418例;分化程度按WHO1997分級法:高分化34例、中分化35例、低分化11例。所有標本均經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)組織切片，行免疫組織化學(xué)染色。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組織化學(xué)(SP法)，鼠抗人MGMT單克隆抗體購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。用已知陽性標本切片做陽性對照，PBS代替一抗做陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷 細胞核、細胞漿或兩者均出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，陽性細胞數(shù)≥10%為陽性，陽性細胞數(shù)＜10%為陰性，結(jié)果的判讀由兩名高級病理診斷醫(yī)師審核。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析處理，結(jié)果采用χ2檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎細胞癌、癌旁組織及腎正常組織的MGMT表達 MGMT在腎正常組織、癌旁組織及腎細胞癌中的陽性表達率依次為 65.0%、76.7%、32.5%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。

2.2 MGMT表達與腎細胞癌病理參數(shù)的關(guān)系MGMT在腎細胞癌中各個病理分級中的表達依次為高分化47.1%、中分化28.6%、低分化 9.1%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05);在各個臨床分期中依次為 T1+T248.6%、T3+T418.6%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。MGMT表達與患者性別、年齡、腫瘤數(shù)量、患病次數(shù)均無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，詳見表1。

3 討論

腎細胞癌的發(fā)生與發(fā)展是多個因素參與的復(fù)雜的過程，與多種癌基因和抑癌基因的表達、調(diào)控以及細胞凋亡有關(guān)［8］。傳統(tǒng)的觀點認為腫瘤的發(fā)生通常是基因損傷累積的結(jié)果，隨著研究的進展，國內(nèi)外許多學(xué)者又發(fā)現(xiàn)基因啟動子異常甲基化和腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，而基因啟動子非甲基化正常狀態(tài)的維持則是靠甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用來實現(xiàn)。O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)是從細菌到哺乳類動物機體中存在的一種獨特DNA修復(fù)酶，其同時發(fā)揮轉(zhuǎn)移酶與甲基接受體的作用，在DNA交聯(lián)形成前將烷化基團從O6-mG的O6位轉(zhuǎn)移到自身半胱氨酸殘基上，使 DNA鏈上的鳥嘌呤損傷修復(fù)，同時MGMT在轉(zhuǎn)甲基后不可逆地失去活性。MGMT是體內(nèi)唯一可以去除這種甲基化損傷的DNA修復(fù)酶［9］，其可將O6鳥嘌呤加合物從DNA上移除，阻止腫瘤的發(fā)生。MGMT不僅在保護細胞免受烷基類物質(zhì)的毒性、突變性和致癌活性中具有決定性作用，同時也維持了其他抑癌基因的功能。Virmani等［10］通過研究發(fā)現(xiàn)MGMT啟動子甲基化程度與宮頸病變發(fā)展程度一致。Allay等［11］發(fā)現(xiàn)MGMT過度表達能明顯降低淋巴瘤的發(fā)生率。Eads等［12］研究發(fā)現(xiàn)Barrett食管發(fā)展到腺癌與MGMT甲基化關(guān)系密切。Park等［13］研究發(fā)現(xiàn)胃癌MGMT啟動子甲基化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分級以及生存期有明顯相關(guān)性。

表1 MGMT表達與腎細胞癌病理參數(shù)的關(guān)系

我們采用免疫組化SP法研究MGMT在20例正常腎組織、30例癌旁組織及80例腎細胞癌中的表達，結(jié)果顯示MGMT在正常腎組織中的陽性表達率為65.0%(13/20)，在癌旁組織中的陽性表達率為76.7%(23/30)，在腎細胞癌中的陽性表達率為32.5%(26/80)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。而且主要表達于細胞漿或細胞核，表明MGMT的低表達可能與腎細胞癌由正常組織發(fā)展而來的過程有關(guān)，在胞漿或胞核中起作用。

本組結(jié)果MGMT在腎細胞癌中的表達明顯低于正常腎組織和癌旁組織，癌組織中的DNA損傷不能得到及時有效地修復(fù)，表明MGMT表達水平降低在腎正常組織逐漸演變?yōu)槟I細胞癌的過程中起到了促進作用，這也與大多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果一致，MGMT可以作為檢測腎細胞癌的腫瘤指標之一。

本組結(jié)果還顯示MGMT的陽性表達與腎細胞癌的分化程度顯著相關(guān)(高、中、低分化分別為47.1%、28.6%、9.1%)(P ＜ 0.05)，與臨床分期也顯著相關(guān)(T1+T248.6%、T3+T418.6%)(P ＜0.05);與患者性別、年齡無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。

MGMT蛋白由O6-烷化鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)，在不需要任何輔助因子或其他蛋白質(zhì)的條件下，特異性地對由致癌劑亞硝酸鹽類引起的胞嘧啶O4或鳥嘌呤O6位上的化學(xué)加合物起作用，可以催化DNA分子中胞嘧啶O4或鳥嘌呤O6位上的甲基、二氯乙基等一大類烷化基，使其轉(zhuǎn)移至自身肽鏈145位的半胱氨酸殘基上使他們失活，使DNA鏈上鳥嘌呤損傷修復(fù)，恢復(fù)DNA原來的化學(xué)結(jié)構(gòu)、狀態(tài)和功能的完整性。大量資料表明，MGMT含量與腫瘤發(fā)生呈明顯負相關(guān)，而MGMT甲基化在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中擔(dān)負重要作用。Cooper等［14］研究顯示，MGMT的表達減少與肺癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，而且更易發(fā)生在伴有轉(zhuǎn)移的晚期肺癌的患者中。

在本實驗中，MGMT在腎細胞癌中表達與其病理組織學(xué)分級呈負相關(guān)，即腫瘤的惡性程度越高而MGMT的表達越低，提示組織細胞中MGMT含量降低后，更多的DNA損傷沒有得到及時有效修復(fù)。Zhou等［15］研究發(fā)現(xiàn)，組織細胞內(nèi)MGMT表達缺失或活性降低會使DNA損傷不能得到及時修復(fù)從而導(dǎo)致基因突變不斷累積，增加細胞癌變機率。由此我們可以推斷，當(dāng)檢測到腫瘤組織中MGMT表達明顯降低時即可認為腫瘤的惡性程度較高，檢測MGMT可作為診斷腎細胞癌的指標之一。MGMT在腎細胞癌中表達水平與其臨床分期也呈負相關(guān)，即T3+T4中表達明顯低于T1+T2，提示MGMT低表達則預(yù)示著腎細胞癌的臨床分期進展較高，其可以作為判斷腎細胞癌預(yù)后的指標，并為臨床治療腎細胞癌提供一定的指導(dǎo)作用。

MGMT蛋白的表達可能成為一種預(yù)判RCC預(yù)后的重要腫瘤標記物，從而指導(dǎo)臨床治療方案的選擇。但是國內(nèi)外對MGMT在腎細胞癌研究甚少，確切發(fā)病機制還不是十分清楚，本次研究收集的標本數(shù)量也不夠充分，這將是我們下一步的研究方向。

［1］ Chow WH，Devesa SS，Warren JL et al.Rising incidence of renal cell cancer in the United States［J］.JAMA，1999，281(17):1628-1631.

［2］ Jemal A，Murray T，Ward E et al.Cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin ，2005，55(1):10-30.

［3］ Janzen NK，Kim HL，F(xiàn)iglin RA et al.Surveillance after radical or partial nephrectomy for localized renal cell carcinoma and management of recurrent disease［J］.Urol Clin North Am，2003，30(4):843-852.

［4］ Patard JJ，Dorey FJ，Cindolo L et al.Symptoms as well as tumor size provide prognostic information on patients with localized renal tumors［J］.J Urol，2004，172(6 Pt 1):2167-2171.

［5］ 楊敏，許建寧.DNA修復(fù)通路間的相互作用及對腫瘤風(fēng)險性評估的影響［J］.國外醫(yī)學(xué)·衛(wèi)生學(xué)分冊，2006，33(6):330-334.

［6］ Matsukura S，Miyazaki K，Yakushiji H，et al.Combined loss of expression of O6-methylguanine-DNA methyltrasferase and hmlh1 accelerates progression of hepatocellular carcinoma［J］.J Surg Oncol，2003，82(3):194-200.

［7］ Dendale R，Vincent-Salmon A，Mouret-Fourme E，et al.Medullary breast carcinoma:prognostic implication of p53 expression［J］.Int J Bio1 Markers，2003，18(2):99-105.

［8］ 馬建輝，何志嵩，郭軍，等.腎細胞癌診斷治療指南［M］//那彥群.中國泌尿外科疾病診斷治療指南.2009版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2009，4-12.

［9］ Fox JG，Wang TC.Inflammation，atrophy，and gastric cancer［J］.J Clin Invest，2007，117:60-69.

［10］ Virmani AK，Muller C，Rathi A，et al.Aberrant methylation duringcervical carcinogenesis［J］.Clin Cancer Res，2001，7(3):584-589.

［11］ Allay E，Veigl M，Gerson SL，Mice overexpressing human O6-alkyl-Guanine-DNA alkyltransferase selectively reduces O6-methylguaninemediated carcinogenic mutations to threshold levels after N-methyl-N-nitrosourea［J］.Oncogene，1999， 18(25):3783-3787.

［12］ Eads CA，Lord RV，Wickramasinghe K，et al.Epigenetic patterns in the progression of esophageal adenocarcinoma［J］.Cancer Res，2001，61(8):3410-3418.

［13］ Park TJ，Han SU，Cho YK，et al.Methylation of O6-methylguanine-DNA methyltransferase gene is associated significantly with Kras mutation，lymph node invasion，tumor staging，and disease free survival in patients with gastric carcinoma［J］.Cancer，2001，92(11):2760-2768.

［14］ Cooper WA，Kohonen Corish MR，Chan C，et al.Prognostic significance of DNA repair proteins MLH1，MSH2 and MGMT expression in non-small-cell lung cancer and precursor lesions［J］.Histopathology，2008，52(5):613-622.

［15］ Zhou ZQ，Manguino D，Kewittk，et al.Spontaneous hepatocellular carcinoma is reduced in transgenic mice over expressing human O6-methylguanine-DNA-methyltransferase［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(22):12566-12571.