表達及臨床意義

劉啟明

(江蘇省睢寧縣人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科,江蘇徐州,221200)

近10年來,肺癌的發(fā)病率和死亡率一直位居各種惡性腫瘤首位。肺癌的發(fā)生也是多因素作用、多基因參與、經(jīng)過多個階段才最終形成的極其復(fù)雜的生物學特征。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 1(DNMT1)是細胞生命所必需的蛋白,其催化的甲基化修飾在調(diào)控細胞正常生長中有重要作用。DNA的甲基化有其重要的生物學意義,它在控制基因的表達、維持染色體的完整性和調(diào)節(jié)DNA的重組等方面都有重要的作用[1]。DNMT1在肺癌組織中表達以及與腫瘤的分期、分化程度、年齡、性別、吸煙等臨床特征的關(guān)系,目前國內(nèi)外研究的較少。本實驗采用免疫組織化學技術(shù)檢測非小細胞肺癌組織中和DNMT1蛋白表達情況,并探討表達與患者臨床特征的關(guān)系。為探討DNMT1在非小細胞肺癌(NSCLC)中的發(fā)病機制、病理診斷、預(yù)后價值以及為選擇治療的靶點提供一定的理論和實驗依據(jù)。現(xiàn)報告如下。

圖1 病理分型

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇本院胸外科2005年3月～2008年10月手術(shù)切除的NSCLC(術(shù)前均未行化療和放療)標本54例。其中男33例、女21例,<60歲者28例;≥60歲者26例;有長期吸煙史22例,無吸煙史32例;鱗癌 25例,腺癌 29例,見圖 1;高分化11例,中分化 31例,低分化12例;Ⅰ期 22例,Ⅱ期10例,Ⅲ～Ⅳ期22例(根據(jù)術(shù)后病理,依據(jù)1997國際抗癌聯(lián)盟制定的肺癌TNM分期標準進行分期)。并分別取癌旁組織(在癌灶周邊5 cm內(nèi)的肺組織)48例及周圍正常肺組織(遠離癌灶5 cm以上,且鏡檢無癌細胞)24例。所有組織標本使用中性甲醛固定,石蠟包埋備用。

1.2 方法

組織學染色:肺組織病理標本使用中性甲醛固定,石蠟包埋,5 μ m連續(xù)切片,常規(guī) HE染色。測定程序性細胞死亡4(PDCD4)和DNMT1的免疫組織化學染色:①石蠟切片置于60℃烤箱中烤片2 h,常規(guī)脫蠟入水;蒸餾水沖洗1次;②0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0即配即用)微波爐抗原修復(fù),加熱至沸騰,自然冷卻;③0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3 min×3次;④3%過氧化氫室溫孵育10 min,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;⑤0.01M PBS沖洗3 min×3次;⑥滴加兔抗人PDCD4、DNMT1及PBS空白對照,于4℃過夜;⑦DAB顯色試劑盒顯色,室溫2 min,顯微鏡下控制反應(yīng)時間,蒸餾水沖洗終止反應(yīng);⑧蘇木素輕度復(fù)染細胞核;⑨中性樹封片,顯微鏡下觀察免疫反應(yīng)陽性結(jié)構(gòu)的著色、分布情況。

1.3 實驗結(jié)果判定

每例標本均用PBS代替一抗作陰性對照,以已知陽性片作為陽性對照。細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒為陽性染色。參考Monica等的半定量計數(shù)方法,根據(jù)腫瘤組織細胞的染色率和染色強度進行判定。在400倍鏡下選取5個視野,計數(shù)至少500個腫瘤細胞中DNMT1蛋白陽性表達細胞所占百分率。腫瘤細胞陽性率<5%為0分,5%≤腫瘤細胞陽性率<25%為1分,25%≤腫瘤細胞陽性率<50%為2分,50%≤腫瘤細胞陽性率<75%為3分,≥75%為4分;根據(jù)染色強度分為 3類,弱為 1分,中等為 2分,強為3分。每個視野陽性細胞率與染色強度得分相乘為每個視野得分,最終得分為5個視野的平均值。規(guī)定0～4分為陰性,5～8分為陽性表達,9～12分為高表達。

2 結(jié)果

2.1 DNMT1的表達

DNMT1在 NSCLC組織、癌旁組織、正常肺組織中表達陽性率分別為39/54(72.2%)、30/48(62.5%)、0/24(0%),癌及癌旁組織與正常組織表達之間的均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。癌及癌旁出現(xiàn)高表達(見表1,圖2)。

表1 DNMT 1在肺癌組織、癌旁及正常組織中的表達(例)

2.2 DNMT1在肺癌組織中表達與TNM分期的關(guān)系

TNMⅠ期DNMT1在肺癌組織中表達陽性率為72.7%(16/22),DNMT1在Ⅱ期肺癌中陽性率為80.0%(8/10),DNMT1在Ⅲ～Ⅳ期肺癌中陽性率為68.2%(15/22)。各組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。

表2 DNMT1在肺癌組織中表達與TNM分期、NSCLC組織分化程度、患者臨床病理特征的關(guān)系(例)

圖2 不同組織DNMT1的表達

2.3 DNMT1的表達與肺癌組織分化程度關(guān)系

DNMT1的表達與肺癌組織分化程度無關(guān),差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

2.4 DNMT1表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

DNMT1的表達與 NSCLC患者的性別、年齡、吸煙史、病理類型等臨床特征差別均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。

3 討 論

DNA的甲基化是由DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶家族DNMTs(DNA C5胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶)介導(dǎo),以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為甲基化供體,將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶(5mC)的一種反應(yīng)。DNA的甲基化有其重要的生物學意義,它在控制基因的表達,維持染色體的完整性和調(diào)節(jié)DNA的重組等方面都有重要的作用。許多研究表明,很多腫瘤的發(fā)生都與相關(guān)抑癌基因啟動子區(qū)域CpG島的甲基化有關(guān)[2-3]。這種基因與細胞周期、DNA的修復(fù)、分化、凋亡、腫瘤轉(zhuǎn)移和血管的形成等密切相關(guān)。

Bestor等[4]于1988年克隆了第一個真核生物C5胞嘧啶甲基化轉(zhuǎn)移酶1-DNMT1,該基因編碼含1620個氨基酸殘基的蛋白質(zhì),分子量為190 kD。DNMT1主要作用是在每次DNA復(fù)制后的修飾過程中,對新合成的DNA鏈進行甲基化。

多種癌組織中一些腫瘤的相關(guān)基因如p73、p16 、E-cadherin 、SOCS-1 、RUNX-3 、cyclinD2 、CDH1、RAR-β等存在啟動子區(qū)域CpG島的甲基化,這些基因具有負調(diào)控細胞周期、錯配修復(fù)、血管生成抑制、細胞黏附等功能,此種修飾可使該基因在癌組織中沉默,致使腫瘤的發(fā)生。

國內(nèi)顧立萍等[5]利用免疫組化SP法研究了DNMT1在胃癌中的表達情況,結(jié)果表明與正常的胃粘膜組織相比,在胃癌組織中,DNA甲基化修飾率有可能顯著提高。吳振啟等[6]檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中DNMT1陽性表達率明顯高于正常組織,說明DNMT1高表達可能與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。翟榮林等[7]發(fā)現(xiàn)結(jié)腸表觀遺傳調(diào)節(jié)是通過甲基化活性增強而不是去甲基化活性減弱實現(xiàn)的。用RT-PCR法研究DNMTs在正常血細胞和急慢性髓細胞性白血病中mRNA的表達時發(fā)現(xiàn),DNMT1急性髓細胞性白血病和慢性髓細胞性白血病的急性期mRNA的表達比正常骨髓細胞分別增高5.3和2.3倍。Park HJ[8]用RT-PCR法測得DNMT1 mRNA在肝癌和正常肝組織中的表達分別為33.3%和40.7%,同時抑癌基因也存在著甲基化現(xiàn)象。楊希等[9]采用免疫組化法檢測95例肺腺癌和癌旁正常組織中的DNMT1的蛋白表達情況,結(jié)果48例患者癌組織呈陽性表達,而癌旁正常組織全部呈陰性表達。亞組分析顯示DNMT1的蛋白陽性表達與性別顯著相關(guān)(P=0.018),女性肺腺癌表達明顯增高,表明DNMT1表達增高可能與體內(nèi)的雌激素水平有關(guān)。通過 Kaplan-meier法和 Log-Rank法分析顯示,DNMT1的蛋白陽性表達是肺腺癌患者預(yù)后差的標志。Kwon YM[10]研究顯示吸煙>65包/年的肺癌患者DNMT1 mRNA表達是吸煙<45包/年肺癌患者的 4.17倍。提示DNMT1陽性表達增高與吸煙的量有關(guān)。以上資料證明DNMT1在許多實體瘤和造血系統(tǒng)的腫瘤中表達均明顯升高。

本組實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn) DNMT1在 NSCLC組織、癌旁、周邊正常組織中表達陽性率分別為39/54(72.2%)、30/48(62.5%)、0/24(0%), 癌、癌旁組織與正常組織表達之間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。表明DNMT1在肺癌組織中呈現(xiàn)高表達,在正常肺組織中表達為陰性,與楊希等[9]研究結(jié)果一致。提示DNMT1可以作為非小細胞肺癌病理診斷的標志物。本組資料顯示DNMT1在肺癌組織中的表達與TNM分期、細胞分化程度、患者年齡、吸煙史均無相關(guān)性。在吸煙和不吸煙的癌組織中表達相近,與楊希等[9]研究資料相同。而與Kwon YM[10]研究在吸煙>65包/年和<45包/年肺癌患者中表達存在著差異不同。在Ⅰ期和Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期之間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。提示DNMT1與NSCLC的預(yù)后相關(guān)性較差。女性、腺癌DNMT1的表達略高于男性、鱗癌,但統(tǒng)計學無差異(P>0.05),與楊希等[9]研究在女性腺癌中表達較高,相對男性對照組有統(tǒng)計學差異不同。是否與樣本量過少有關(guān),有待進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn):①DNMT1在NSCLC癌組織、癌旁組織中出現(xiàn)高表達,在正常肺組織中表達缺失,提示DNMT1參與NSCLC發(fā)病機制,可以作為病理診斷NSCLC的標志物。②DNMT1與非小細胞肺癌的分化程度、TNM分期、患者的發(fā)病年齡、性別、吸煙史、組織學類型均無顯著性差異。不能作為臨床預(yù)后指標。

[1] Lee T S,Kim J W,Kang G H,et al.DNA hypermethylation of CAGE promotors in squamous cell carcinoma of uterine cervix[J].Ann NY A cad Sci,2006,10(91):218.

[2] Jing F,Zhang J,Tao J,et al.Hypermethylation of tumor supressor genes BRCA1,p16 and 14-33 sigma in serum of sporadic breast cancer patients[J].Onkologie,2007,30(1-2):14.

[3] 田德增.CpG ODN對2型糖尿病患者外周血單個核細胞功能的影響[J].實用臨床醫(yī)藥雜志,2006,10(7):100.

[4] Bestor TH.DNA methyltransferase of mammals[J].Human Molecular Genetics,2009,9(16):2395.

[5] 顧玉萍,劉 斌,邢傳平,等.胃癌組織中 DNMT1的表達及其臨床病理意義[J].西北國防醫(yī)學雜志,2008,29(5):330.

[6] 吳振啟,張 旭,劉 毅,等.DNM T1和DNMT 3b基因在人膀胱癌組織和細胞中的表達及意義[J].華中科技大學學報,2009,38(3):321.

[7] 翟榮林,蔡開琳,王國斌,等.DNMT1,DNM T3a,DNM T3b和HM T在不同結(jié)腸癌細胞系的表達及意義[J].世界華人消化雜志,2008,16(4):426.

[8] Park H J,Yu E,Shim Y H.DNA methyltransferase expression and DNA hypermethylation in human hepatocellular carcinoma[J].Cancer Lett,2006,4(233):271.

[9] 楊 希,高 鵬,薛玉文,等.肺腺癌中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1的表達[J].山東大學學報(醫(yī)學版),2009,47(1):30.

[10] Kwon Y M,Park J H,Kim H,et al.Different susceptibility of increased DNM T1 expression by exposure to tobacco smoke according to histology in primary non small lung cancer[J].Cancer Res Clin Oncol,2007,133(4):219.