王恩旺，楊小龍，鄧小樂(lè)

(1.馬鞍山市人民醫(yī)院 心胸外科，安徽 馬鞍山 243000;2.皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 心胸外科，安徽 蕪湖 241001)

p300/CBP為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，是同源轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，具有內(nèi)在乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。Smad4為抑癌基因，是目前發(fā)現(xiàn)的惟一一種CO-Smads，其蛋白產(chǎn)物是TGF-β超家族受體的直接底物。p300/CBP可通過(guò)與Smads結(jié)合增強(qiáng)TGF-β誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)的方法(SABC法)，測(cè)定肺癌和正常肺組織中p300/CBP、Smad4蛋白的表達(dá)，觀察其結(jié)果與肺癌臨床病理的關(guān)系，并分析它們之間的相關(guān)性，旨在探討 p300/CBP、Smad4在NSCLC發(fā)病機(jī)制中的作用，同時(shí)為p300/CBP、Smad4用于NSCLC的抗腫瘤治療提供一定的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選用2008年1月～2009年1月皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院術(shù)前未經(jīng)放療和化療的原發(fā)性肺癌手術(shù)標(biāo)本(石蠟包埋)60例。取上述標(biāo)本中距離腫瘤邊緣6 cm以上的正常肺組織20例、并經(jīng)病理檢查排除腫瘤累及。標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，其中一片行HE常規(guī)染色用于病理診斷。組織病理分型、分級(jí)由病理科診斷。60例NSCLC中男性43例，女性17例?！?5歲33例，＜55歲27例。病理分型:肺鱗癌38例，肺腺癌22例。中心型肺癌28例，周?chē)头伟?2例。無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例。按1997年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)新修訂的肺癌TNM分期:ⅠA期3例、ⅠB期14例、ⅡA期12例、ⅡB期17例、ⅢA期14例，無(wú)ⅢB、Ⅳ期病例。腫瘤直徑＞3 cm 29例，≤3 cm 31例。分化程度:高分化+中分化為39例，低分化21例。

1.2 主要試劑 Smad4濃縮型兔多克隆抗體(武漢博士德)，p300/CBP濃縮型鼠抗人單克隆抗體(NeoMarker)，SABC免疫組化試劑盒和3-3'二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德)。

1.3 方法 免疫組織化學(xué)SABC法60例肺鱗癌和肺腺癌均行 Smad4(1∶50)、p300/CBP(1∶100)免疫組織化學(xué)染色。染色方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以磷酸緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照，Smad4、p300/CBP陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 Smad4蛋白定位于肺泡上皮細(xì)胞漿(胞核)或癌細(xì)胞漿(胞核)內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色細(xì)小顆粒者為陽(yáng)性染色。根據(jù)染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比分為:陽(yáng)性細(xì)胞＜20%為陰性，陽(yáng)性細(xì)胞≥20%為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4.2 p300/CBP蛋白定位于癌細(xì)胞核內(nèi)和支氣管黏膜上皮細(xì)胞核內(nèi)，部分呈核-漿型，細(xì)胞核被染成棕黃色為p300/CBP陽(yáng)性表達(dá)。每張切片在400倍鏡下觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，共計(jì)500個(gè)細(xì)胞，無(wú)p300/CBP陽(yáng)性表達(dá)者計(jì)0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11% ～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。再按染色強(qiáng)度評(píng)分:無(wú)色為0，淡色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。最后將陽(yáng)性細(xì)胞所占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分比的染色分級(jí)與強(qiáng)度分級(jí)兩項(xiàng)指標(biāo)評(píng)分相乘，得出染色等級(jí)評(píng)分:“-”(0～2)，“+”(3～4)，“?”(6～8)，“?”(9～12)?！?”為陰性表達(dá)，“+”、“?”及“?”為陽(yáng)性表達(dá)，其中“?”和“?”為過(guò)度表達(dá)［1］。

1.4.3 正常肺組織分級(jí)參照上述標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用χ2檢驗(yàn)分析各組計(jì)數(shù)資料;NSCLC中p300/CBP表達(dá)與腫瘤各臨床病理特征之間的分析，不同分組之間采用秩和檢驗(yàn)(Mann-Whitney U，或 Kruskal-Wallis Test);正常肺組織中及NSCLC中p300/CBP、Smad4的表達(dá)、相互之間的關(guān)系及雙向有序資料采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P＜0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

p300/CBP在正常肺組織中呈中-低表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為35.0%(7/20)，未發(fā)現(xiàn)有過(guò)表達(dá)(0/20)，在NSCLC組織中陽(yáng)性表達(dá)率為65.0%(39/60)，過(guò)表達(dá)率為51.7%(39/60)，主要表達(dá)于細(xì)胞核(見(jiàn)圖1～6)。

Smad4在正常肺組織中呈高表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為90.0%(18/20)，在NSCLC組織中逐漸降低呈中-高度表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為63.3%(38/60)，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中(見(jiàn)圖1～6)。

p300/CBP和Smad4均與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期等臨床病理學(xué)參數(shù)有關(guān)(P＜0.05)，在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，均隨著腫瘤分期的增高而降低(見(jiàn)表1、2)。

p300/CBP的表達(dá)還與NSCLC分化有關(guān)，在中、高分化肺癌細(xì)胞的表達(dá)明顯高于在低分化肺癌細(xì)胞中的表達(dá)(P ＜0.05)，呈輕度負(fù)相關(guān) (rs=-0.287，P=0.026)，見(jiàn)表1。

p300/CBP、Smad4在NSCLC組織中陽(yáng)性表達(dá)率呈中度負(fù)相關(guān)(rs=-0.413，P=0.001)，見(jiàn)表3。

表1 p300/CBP在NSCLC臨床病理特征不同組之間的表達(dá)Tab 1 p300/CBP expression by classification of clinicopathologic features in NSCLC

表2 Smad4在NSCLC臨床病理特征不同組之間的相關(guān)性Tab 2 Correlation of Smad4 expression by classification of the clinicopathologic features in NSCLC

表3 p300/CBP、Smad4在NSCLC表達(dá)關(guān)系Tab 3 Relationship between expression of Smad4 and p300/CBP in NSCLC

4 討論

p300/CBP是同源轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，分別位于22p13和16p13.3，具有內(nèi)在的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，催化可逆的組蛋白乙?；?。p300/CBP本身亦可減緩由染色質(zhì)本身結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的啟動(dòng)子抑制作用和恢復(fù)靶基因啟動(dòng)子基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄器效應(yīng)［2］。

p300/CBP作為原癌蛋白，可抑制腫瘤，但可有異?；罨?，為誘導(dǎo)腫瘤的癌蛋白。p300/CBP是細(xì)胞周期負(fù)調(diào)節(jié)基因。p300/CBP通過(guò)活化AP-1，調(diào)控cyclin D1基因表達(dá)。E2F家族過(guò)度表達(dá)與肺癌密切相關(guān)，并且隨腫瘤分期升高而增高。E2F可在p300/CBP賴(lài)氨酸殘基上被乙?；?，在分子水平上CDK介導(dǎo)p300/CBP和E2F-1相互作用、促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入不可逆的過(guò)程［3］。p21WAF/CIP1可上調(diào)p300/CBP活性表達(dá)，從而抑制細(xì)胞周期運(yùn)行。DNA的復(fù)制和修復(fù)同樣需要p300/CBP的參與。p53突變是不同類(lèi)型肺癌中最常見(jiàn)的基因改變，且出現(xiàn)的頻率比其他腫瘤高。突變型p53不僅失去了正常的抑癌作用，而且還促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化。p300/CBP的CH1區(qū)域?qū)53有泛素連接酶活性，p300/CBP通過(guò)Mdm2依賴(lài)或非依賴(lài)機(jī)制調(diào)節(jié)p53泛蛋白化作用和降解，有助于控制 p53 穩(wěn)定性［4］。p53 可被包含 p53、Mdm2 和p300/CBP的三元絡(luò)合物降解。在p53信號(hào)通路中，p300/CBP還通過(guò)乙?；筂dm2失活，引發(fā)細(xì)胞凋亡［5］。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，p300/CBP在NSCLC的性別、年齡、腫瘤部位、病理類(lèi)型各不同組之間的表達(dá)，P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。p300/CBP在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織(P＜0.05)，呈輕度負(fù)相關(guān) (rs=-0.372，P=0.003)。p300/CBP 的表達(dá)隨著腫瘤級(jí)別的增高而降低，在中、高分化肺癌細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于在低分化肺癌細(xì)胞中的表達(dá)(P＜0.05)，呈輕度負(fù)相關(guān) (rs=-0.287，P=0.026)。p300/CBP的表達(dá)亦隨著腫瘤分期的增高而降低，三組之間的表達(dá)有明顯差異 (P＜0.05)，并呈中度負(fù)相關(guān) (rs=-0.573，P=0.001)。CBP 在早期上皮細(xì)胞癌中過(guò)度表達(dá)已被證實(shí)，CBP的過(guò)度表達(dá)、或優(yōu)先使用是通過(guò)特定活躍的轉(zhuǎn)錄因子，或兩者聯(lián)合體，并且在肺癌中不抑制細(xì)胞增殖和死亡［6］。Smad4系位于l8q21.1上的抑癌基因，其蛋白產(chǎn)物是TGF-β超家族受體的直接底物。TGF-β家族是為數(shù)不多的內(nèi)源性細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)蛋白，主要調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移、免疫反應(yīng)、血管生成、凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。TGF-β信號(hào)通路失調(diào)能夠促進(jìn)腫瘤發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的進(jìn)程，恢復(fù)TGF-β信號(hào)通路則可減少人類(lèi)腫瘤(如肺癌)的發(fā)生［7］。TGF-β需Smads將刺激所產(chǎn)生的信息從細(xì)胞內(nèi)傳遞至細(xì)胞核。Smad4蛋白是目前發(fā)現(xiàn)的惟一一種CO-Smads，因?yàn)槠淇梢院推渌鸖mad蛋白形成復(fù)合體，有效地傳遞任務(wù)而居關(guān)鍵性地位，目前對(duì)其調(diào)控TGF-β誘導(dǎo)的基因表達(dá)研究較多:Ke Z等［8］應(yīng)用免疫組化等方法分析肺癌組織中各種不同血管生成因子表達(dá)以及瘤內(nèi)微血管密度，結(jié)果顯示Smad4表達(dá)缺失和瘤內(nèi)微血管密度具有顯著的相關(guān)性，提示Smad4作為調(diào)節(jié)因子在肺癌的血管發(fā)生中起著重要的作用。Smad4基因發(fā)生突變，將伴隨著癌癥的發(fā)生。若調(diào)節(jié)Smad4蛋白在細(xì)胞中的功能，可以進(jìn)一步抑制癌癥的生成［9，10］。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常肺組織Smad4陽(yáng)性表達(dá)率為90.0%，肺癌組織中Smad4蛋白的表達(dá)率為63.3%，低于正常組織(P＜0.05)。Smad4在NSCLC的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小和病理類(lèi)型和分化程度各不同組之間的表達(dá)，P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Smad4在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織(P＜0.05)，呈輕度正相關(guān)(rs=0.295，P=0.022)。Smad4陽(yáng)性表達(dá)率隨著腫瘤分期的增高而降低 (P＜0.05)，呈中度正相關(guān)(rs=0.487，P=0.000)。提示Smad4表達(dá)與肺癌發(fā)生發(fā)展、生物學(xué)行為及其預(yù)后有密切關(guān)系，其作用機(jī)制與Smad4本身的生物學(xué)作用有關(guān)。

p300/CBP可通過(guò)與Smads結(jié)合增強(qiáng)TGF-β誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。p300/CBP在Smad4的存在下，增強(qiáng)TGF-β及 Smads誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。p300/CBP、Smad4的有機(jī)結(jié)合，以及協(xié)同激活子的參與，能使TGF-β 誘導(dǎo)的基因表達(dá)增強(qiáng)［11］。p300/CBP、Smads蛋白的低表達(dá)可使TGF-β的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的中斷，從而使上皮細(xì)胞逃脫了TGF-β對(duì)其生長(zhǎng)抑制作用。Smads、p300/CBP可作為整體與不同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，但其他轉(zhuǎn)錄因子也可和Smads競(jìng)爭(zhēng)性地與p300/CBP結(jié)合、或直接干擾Smads而妨礙Smads介道的轉(zhuǎn)錄。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:正常肺組織中p300/CBP與 Smad4的表達(dá)無(wú)相關(guān)(rs=-0.105，P=0.660)，NSCLC組織中 p300/CBP與Smad4的表達(dá)呈中度負(fù)相關(guān)(rs=-0.413，P=0.001)，且均與NSCLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和 TNM分期相關(guān)，提示在NSCLC的一系列病程發(fā)展過(guò)程中，高表達(dá)的p300/CBP與Smad4的協(xié)同作用可能是NSCLC腫瘤細(xì)胞永生化的重要因素。故聯(lián)合檢測(cè)p300/CBP和Smad4的表達(dá)，在預(yù)測(cè)NSCLC的惡性生物學(xué)行為方面可能比單因素檢測(cè)更具有意義，預(yù)計(jì)聯(lián)合使用分別針對(duì) p300/CBP及 Smad4靶向藥物，有望提高NSCLC治療的有效率。

總之，肺癌的發(fā)生是多因素、多步驟的過(guò)程，可同時(shí)有原癌基因激活和抑癌基因滅活。隨著對(duì)p300/CBP結(jié)構(gòu)和功能等相關(guān)研究的不斷深入，將有助于在人類(lèi)細(xì)胞中具有抗癌藥物一樣功能的p300/CBP抑制劑的問(wèn)世，為腫瘤的防治工作帶來(lái)新的契機(jī)。

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