黃德芬 李成瓊 司 軍 任雪松 宋洪元

（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶市蔬菜學(xué)重點實驗室，重慶 400716）

甘藍(lán)（Brassica oleraceavar.capitataL.）黑腐病是由黃單胞桿菌屬甘藍(lán)黑腐黃單胞桿菌（Xanthommonas campestrispv. campestris）引起的一種毀滅性病害（李樹德，1995）。該病曾在19世紀(jì)90年代嚴(yán)重影響了美國威斯康星州東南部地區(qū)的甘藍(lán)生產(chǎn)（Massomo et al.，2004）；20世紀(jì)50年代末在我國華北地區(qū)發(fā)生（陜西省植物保護(hù)研究所，1992），到了80年代已流行于全國各地，極大地威脅著甘藍(lán)生產(chǎn)，嚴(yán)重時減產(chǎn) 70%（李明遠(yuǎn)，1993）。甘藍(lán)黑腐病病原菌生理小種的劃分和抗病性鑒定的方法直接關(guān)系到甘藍(lán)抗病育種工作的開展和進(jìn)程，本文就國內(nèi)外常見的生理小種劃分和抗病性鑒定方法作一簡要闡述，以供我國甘藍(lán)抗黑腐病育種工作者參考。

1 主要癥狀

黑腐病以甘藍(lán)成株期發(fā)病最為常見，主要為害葉片，病菌由水孔侵入，多從葉緣發(fā)生，初呈水浸狀病斑，后向內(nèi)擴(kuò)展呈“V”字形、黃褐色枯斑，病斑周圍常有黃色暈圈；有時病菌沿葉脈向內(nèi)擴(kuò)展，使葉片產(chǎn)生黃褐色大斑或葉脈變黑呈網(wǎng)狀；病菌也可從傷口侵入，在葉片的任何部位形成不規(guī)則的黃褐色病斑。重病株的莖部和根部維管束變黑，形成黑色空心干腐，葉內(nèi)包心不緊，最終植株枯死。植株腐爛時沒有臭味，此特點有別于軟腐病。

2 病原菌生物學(xué)特征

甘藍(lán)黑腐病菌呈短桿狀，大小為（0.4～0.5）μm×（0.7～3.0）μm，單極生鞭毛，沒有芽孢，但有莢膜，單生，部分為鏈生，經(jīng)革蘭氏染色后表現(xiàn)為陰性，屬于好氣性細(xì)菌。在牛肉瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落呈灰黃色、圓形或稍不規(guī)則，表面濕潤有光澤，但不粘滑；在馬鈴薯培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落為淡黃色，并呈放線狀。生長發(fā)育最適溫度為 25～30 ℃，最高溫度可達(dá) 38～39 ℃，最低溫度為5 ℃，在51 ℃條件下，病菌最多存活10 min；生長發(fā)育的最適濕度為80%～100%（Swings & Civerolo，1993），對干燥的適應(yīng)性很強(qiáng)，可存活12個月（Massomo et al.，2004），喜弱堿性（pH 7.4）環(huán)境。

3 生理小種劃分

黑腐病菌生理小種的分化較為復(fù)雜，Kamoun等（1992）利用十字花科植物中的一些品種作為鑒別寄主進(jìn)行了劃分生理小種的研究，將病原菌劃分成5個生理小種，即0、1、2、3、4號小種（表1）。之后，Vicente等（2001）利用 Wirosa F1（Brassica oleracea）、Just Right Hybrid Turnip（Brassica rapa）、Florida Broad Leaf Mustard（Brassica juncea）、Seven Top Turnip（Brassica rapa）、Miracl F1（Brassica oleracea）、PI199947（Brassica carinata）和 Line 14R of Cobra（Brassica.napus）等 7個十字花科蔬菜品種作為鑒別寄主將Xanthomonas campestrispv.campestris劃分為6個生理小種，即1、2、3、4、5和6號小種（表2），其中1號小種占整體小種的62%，4號小種占32%，其余4個小種比較少，共占了6%。由此看出，生理小種1和生理小種4是引起蕓薹屬作物感染黑腐病最普遍的小種。Jensen等（2010）采用rep-PCR技術(shù)對尼泊爾的44個Xanthomonas campestrispv.campestris致病菌株進(jìn)行生理小種劃分，將其劃分為5個生理小種，即 1、4、5、6和 7號小種。目前國際上比較常用的是 Vicente等（2001）的劃分標(biāo)準(zhǔn)。

國內(nèi)關(guān)于甘藍(lán)黑腐病菌生理小種的分化研究還未見報道，但已有一些關(guān)于其致病力分化方面的研究。李經(jīng)略等（1990）研究了北京、哈爾濱、重慶、陜西 4地的甘藍(lán)黑腐病菌，結(jié)果表明不同生態(tài)環(huán)境形成的菌系對甘藍(lán)苗期的致病力存在明顯的分化現(xiàn)象，其中在陜西分離的YL-1致病力最強(qiáng)。程伯瑛等（2002）研究了來自山西和陜西的2個菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這2個菌株在同一甘藍(lán)品種上的致病力表現(xiàn)略有差異。

表1 Kamoun等（1992）劃分黑腐病菌生理小種的方法

表2 Vicente等（2001）劃分黑腐病菌生理小種的方法

4 苗期抗病性鑒定

關(guān)于甘藍(lán)黑腐病鑒定方法的研究較多，分別從群體、個體、細(xì)胞和分子等水平進(jìn)行了研究，下面介紹幾種常用的苗期抗病性鑒定方法。

4.1 剪葉接種

剪葉接種（龔靜 等，2001）：用滅菌解剖刀蘸取濃度為1.0×108cfu·mL-1的菌液，在供試幼苗（4～6片真葉）葉片尖端垂直主脈的方向剪0.5～1.0 cm的切口接種。每剪1次均需蘸取菌液，每株剪2片，接種前后分別保濕24 h，接種后5～7 d調(diào)查發(fā)病情況，以葉片為單位，分級標(biāo)準(zhǔn)采用“八五”期間農(nóng)業(yè)部統(tǒng)一制定的苗期抗病性鑒定方法及劃分標(biāo)準(zhǔn)。

4.2 離體剪葉接種

離體剪葉接種（簡元才和釘貫靖久，1994）：當(dāng)植株長到4～5片真葉時，取從心葉往下數(shù)的第3片葉，然后將其從葉頂端往葉柄方向量取6 cm剪下。將小夾子浸入濃度為1.0×108cfu·mL-1的菌液中，在離近葉端至主葉脈 0.5 cm處剪葉接種。將接種后的葉片放入滅菌后鋪有濾紙的塑料盒內(nèi)，加無菌水保濕 1～2 h取出，在葉片的接種傷口處滴 1滴菌液，放入28 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，5 d后調(diào)查發(fā)病情況。按三角形面積公式計算病斑面積（病斑面積=寬×高/2）?？剐苑旨墭?biāo)準(zhǔn)為：免疫（I）或高抗（HR），0＜病斑面積≤0.5 cm2；抗?。≧），0.5 cm2＜病斑面積≤2.0 cm2；耐?。═），2.0 cm2＜病斑面積≤3.0 cm2；感病（S），病斑面積＞3.0 cm2。

4.3 噴霧接種

噴霧接種（李永鎬和徐麗波，1990）：接種前1 d將4～6片真葉期的植株保濕24 h，第2天早晨用小型噴霧器將濃度為1.0×108cfu·mL-1的菌液均勻噴于葉片表面，每株用量1 mL，接種后保濕24 h，14 d后調(diào)查發(fā)病情況，以葉片為單位，病情分級標(biāo)準(zhǔn)采用“八五”期間農(nóng)業(yè)部統(tǒng)一制定的苗期抗病性鑒定方法及劃分標(biāo)準(zhǔn)。

4.4 針刺接種

針刺接種（崔瑞峰，2004）：在植株 4～6片真葉期，用滅菌后的接種針蘸取菌液，在主脈至葉緣0.5～1.0 cm處進(jìn)行針刺接種，接種菌液濃度為1.0×108cfu·mL-1，每接種1次均需蘸取菌液，接種前后分別保濕24 h，每株處理2片葉，接種后5～7 d調(diào)查發(fā)病情況，以葉片為單位，病情分級標(biāo)準(zhǔn)采用“八五”期間農(nóng)業(yè)部統(tǒng)一制定的苗期抗病性鑒定方法及劃分標(biāo)準(zhǔn)。

4.5 水孔接種

水孔接種（Staub & Willians，1972）：將4～6片真葉期的植株放入泡沫塑料箱內(nèi)，每箱底部裝1～2 cm靜水，將濃度為1.0×109cfu·mL-1的菌液噴到植株表面，至葉片潮濕為止，接種后保濕48 h，12 d后調(diào)查發(fā)病情況。病情分級標(biāo)準(zhǔn)參照Staub和Willians（1972）的劃分標(biāo)準(zhǔn)。

4.6 吐水接種

吐水接種（肖崇剛，1994）：在接種前1 d將4～6片真葉期的植株保濕24 h，使其邊緣產(chǎn)生露珠，用特制玻璃纖維蘸取濃度為 1.0×109cfu·mL-1的菌液通過吐水液滴接種，分別作保濕12 h與不保濕處理，然后將植株放入15～20 ℃溫室內(nèi)自然條件生長，接種14 d后調(diào)查發(fā)病情況。病情分級標(biāo)準(zhǔn)采用“八五”期間農(nóng)業(yè)部統(tǒng)一制定的苗期抗病性鑒定方法及劃分標(biāo)準(zhǔn)。

噴霧法接種是國內(nèi)外采用較為普遍的一種方法，李永鎬和徐麗波（1990）認(rèn)為，噴霧接種后病原菌在水孔處繁殖，并擴(kuò)展蔓延，這種方法能充分體現(xiàn)出寄主的抗擴(kuò)展能力，還能夠反映其抗侵入的特性，能夠比較全面地反映寄主的抗病性，其鑒定結(jié)果與田間自然發(fā)病情況相似，而且該方法還具有簡單、方便、快速、省時、省力等特點，比較適用于甘藍(lán)黑腐病的抗病性鑒定。龔靜等（2001）采用噴霧法對38份甘藍(lán)材料進(jìn)行抗病性鑒定，結(jié)果表明各材料之間病情指數(shù)差異較大，能夠比較明顯區(qū)分抗感材料。但噴霧法必須要注意保濕，防止漏接現(xiàn)象。吐水法接種可以避免漏接現(xiàn)象，而且鑒定結(jié)果較為準(zhǔn)確，但費時費力，接種難度比較大。龔靜等（2001）研究認(rèn)為用剪葉法接種后，各材料的抗病性差異表現(xiàn)不明顯，不能較為準(zhǔn)確地區(qū)分抗感材料，所以該接種方法不適于甘藍(lán)黑腐病的抗病性鑒定，這與肖崇剛（1994）的研究結(jié)果較為一致。離體接種不易受外界條件的影響，環(huán)境條件易于控制，可周年進(jìn)行，且省時省力（簡元才和釘貫靖久，1994）。離體剪葉法操作比較方便，而且不受外界環(huán)境的影響，較易控制。王超等（2000）認(rèn)為，離體剪葉法比較適用于甘藍(lán)黑腐病的苗期抗病性鑒定。目前國內(nèi)外關(guān)于離體剪葉法的研究還比較少，在今后接種研究中有更廣闊的前景。

5 問題與展望

目前，我國關(guān)于甘藍(lán)黑腐病菌生理小種分化的研究比較多，但對其鑒定系統(tǒng)尚未見報道；已收集了一些致病力不同的相關(guān)菌株，并進(jìn)行了菌系分化研究，但沒有開展系統(tǒng)的生理小種鑒定研究。在今后的研究工作中，還應(yīng)加大對其生理小種分化的鑒定方法研究，找到一套詳細(xì)的甘藍(lán)黑腐病生理小種鑒別寄主，以更好的了解我國甘藍(lán)黑腐病菌生理小種的分布情況，對有針對性地進(jìn)行甘藍(lán)抗黑腐病育種具有重要意義。

從上述甘藍(lán)抗病性鑒定方法可以看出，均是通過接種甘藍(lán)黑腐病菌后觀察其鑒定材料的外觀來確定其抗病性，而這些外在表現(xiàn)癥狀都是受基因所控制的，所以最可靠、最直接確定一個材料的抗病性的方法是通過分子輔助選擇來檢測該材料是否具有抗病基因。目前已取得了一些進(jìn)展，Bain（1955）認(rèn)為甘藍(lán)對黑腐病的抗性是由1個或多個顯性基因控制的；Hunter（1987）在鑒定B. napus抗病品種PI436606后認(rèn)為甘藍(lán)對黑腐病的抗性由1個顯性基因控制的；Dickson和Hunter（1987）認(rèn)為此抗性受1對隱性基因控制，并在另一耐黑腐病的株系中發(fā)現(xiàn)多個修飾基因；張峰和宋文芹（1999）利用AFLP-銀染法發(fā)現(xiàn)其中1個400 bp的抗病標(biāo)記可能與甘藍(lán)黑腐病抗性基因緊密連鎖。在今后的工作中，還需要進(jìn)一步研究抗黑腐病的基因，尋找并克隆出對甘藍(lán)黑腐病免疫或高抗的單基因，從而完善甘藍(lán)黑腐病的抗性鑒定方法，為甘藍(lán)的抗病育種提供依據(jù)。

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