阮麗麗 杭州市紅十字會醫(yī)院神經內科 杭州 310003

糖尿病性腦病變是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為認知功能障礙、認知力減弱、智力降低、情感障礙等。本實驗應用鏈脲佐菌素（STZ）制備1型糖尿病模型大鼠，觀察糖尿病大鼠的認知功能，以及大鼠海馬組織細胞色素C（Cyt-c）蛋白表達的改變，探討糖尿病對認知功能的影響及其機制，現(xiàn)報道如下。

1 實驗材料

1.1 動 物 SD雄性大鼠20只，體質量140～180g，SPF級，由浙江大學醫(yī)學院動物實驗中心提供（SCXK[浙]2003—0001）。

1.2 主要儀器 One-Touch-Ⅱ型快速血糖儀及血糖試紙（美國強生公司）；Morris水迷宮及分析軟件（浙江大學藥學院藥物研究所）；WFZ800-3型紫外可見單光束分光光度計（北京瑞利光學儀器廠）；分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司產品）；電泳儀（BIORAD，Power PAC200）；電泳濕轉儀（BIO-RAD，Trans-Blot SD）。

1.3 主要試劑 鏈脲佐菌素（STZ）、Cyt-c及GAPDH抗體（Santa Cruz公司）；山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物試劑公司）；Western blotting相關試劑（碧云天生物技術研究所）。

2 實驗方法

2.1 模型建立 20只大鼠用隨機數(shù)字表隨機分為正常組、實驗組各10只。兩組大鼠均予標準鼠食飼養(yǎng)，并給飲5%葡萄糖溶液。實驗組大鼠禁食24h，按60mg/kg腹腔注射鏈脲霉素（pH 4.4檸檬酸緩沖液配制，置于冰浴備用）。第4天尾部采血以One-Touch-Ⅱ型快速血糖測定儀測每只大鼠空腹血糖，血糖＞15mmol/L大鼠為造模成功。30天后，進行Morris水迷宮測定，處死后取大腦海馬組織進行細胞色素C蛋白測定。

2.2 Morris水迷宮測定方法 主要由圓形水池和自動攝象及電腦分析系統(tǒng)組成。水池上方的攝像機同步記錄大鼠的運動軌跡。測試前將水注入池中，水深30cm（即水面高出站臺表面1cm，使大鼠不能見到站臺），放入碳素墨水使之成為黑色，水溫22～25℃。實驗時要求各種實驗條件保持不變。每只動物第1天訓練2次，使之學習并產生記憶，入池位置為站臺的對象限及鄰象限，于象限邊1/2弧度處將動物頭朝池壁入水，120s未找到站臺者，將其引至站臺，放置30s引導其學習與記憶。試驗共進行5天，前4天為訓練時間，第5天測試。數(shù)據采集及圖像分析均由圖像自動監(jiān)視和處理系統(tǒng)完成。觀察指標：觀察120s內找到平臺的時間（潛伏期）；搜尋平臺的策略（直線式，記分4分；趨向式，記分3分；隨機式，記分2分；圓圈式，記分1分）。

2.3 大鼠海馬組織細胞色素C（Cyt-c）蛋白測定 取單側海馬組織200mg加入含蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液，4℃勻漿后10000g離心15min，上清蛋白定量后，取50μg蛋白，變性，行聚丙酰胺凝膠電泳，轉移至硝酸纖維膜，6%脫脂奶粉室溫封閉1h，4℃過夜，洗滌后膜和兔抗鼠 Cyt-c抗體（1∶1 000）作用，4℃過夜，洗滌后加入辣根過氧化酶結合的抗兔IgG（1∶5 000），化學發(fā)光試劑檢測，X線片顯影；將目的蛋白發(fā)光后的NC膜用strip液將一抗洗脫，結合內參GAPDH（1∶2 000），余步驟同前。定量分析采用分子生物學圖像分析系統(tǒng)測定各目的條帶積分灰度值，所測結果為目的條帶除以內參條帶灰度值的比值。

2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件包對實驗數(shù)據進行方差分析，計量資料先行方差齊性檢驗。方差齊性采用LSD-t檢驗；若方差不齊，則采用Tamhane’St檢驗。

3 實驗結果

3.1 Morris水迷宮潛伏期與搜索策略檢測結果 實驗第5天，實驗組大鼠潛伏期比正常組明顯延長（P＜0.01），搜索策略明顯劣于正常組（P＜0.01），見表1。

表1 兩組Morris水迷宮第5天潛伏期和搜尋平臺策略結果比較

3.2 大腦海馬組織Cyt-c蛋白表達 Western blotting結果顯示，正常組Cyt-c蛋白表達量0.65±0.21，實驗組為 1.13±0.42，實驗組較正常組明顯升高（P＜0.05）。

4 討論

有研究表明，糖尿病與認識功能障礙有密切聯(lián)系[1]，糖尿病腦病患者主要表現(xiàn)輕、中度認知功能障礙。由于這些表現(xiàn)并不十分嚴重或缺乏對這方面的了解而常被忽視。對動物的認知過程一般從行為學、電生理、腦成像、組織化學及分子生物學等方面進行分析。本實驗采用的Morris水迷宮就是一種分析行為學方法。正常動物在經過3～4個實驗日訓練后，很快就學會以最快、最佳的速度和策略搜索到站臺確切位置；如果破壞海馬系統(tǒng)，可使動物的反應時間延長，搜索目標的軌跡混亂，由此可檢驗腦的某結構對空間認知的影響[2]。本實驗結果表明，與正常組比較，糖尿病大鼠潛伏期明顯延長、搜索策略明顯變差，說明糖尿病大鼠存在著空間學習記憶障礙，提示該認知功能障礙可能與海馬功能受損有關。

Christelle等[3]報道糖尿病是引起Alzheimer?。ˋD）的一個高危因素。神經元細胞的死亡是AD的一個特征，而細胞的死亡與細胞凋亡密切相關。糖尿病時細胞凋亡增加可能與糖尿病引起的高血糖有關[4]。Brownlee等[5]提出，高血糖引起線粒體中超氧陰離子生成過多，導致組織細胞發(fā)生氧化應激，使機體處于易損狀態(tài)，線粒體膜通透性發(fā)生改變。Cyt-c是線粒體呼吸鏈中傳遞電子的載體，由核基因編碼的多肽和線粒體編碼的亞鐵血紅素組成，松散地結合在富含不飽和脂肪酸的線粒體內膜外側心磷脂上，不能自由通過線粒體外膜。目前，Cyt-c促進細胞凋亡作用正逐步闡明[6]，當?shù)蛲龃碳ひ蜃右鹁€粒體膜通透性發(fā)生改變，Cyt-c從間隙釋放到胞漿后，首先與胞漿中的凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）結合，聚合成為復合體，繼而啟動caspase-9形成全酶，然后裂解，最后導致caspase-9前體自動活化，活化的caspase-9分裂，繼續(xù)激活下游的capases成員，誘導細胞發(fā)生凋亡[7-8]。壞死和凋亡雖然為細胞死亡的兩種方式，但兩者發(fā)生過程中的某些環(huán)節(jié)可能重疊，如線粒體膜通透性的改變[9]。本實驗結果顯示，正常大鼠海馬組織中Cyt-c表達很少，糖尿病大鼠Cyt-c表達明顯增多。我們認為，造模后，高血糖引起線粒體膜通透性發(fā)生改變，釋放出Cyt-c并結合至核膜，誘導DNA裂解，進入非caspase依賴性細胞凋亡過程[10]；Cyt-c同時也對下游caspase進行活化，進入caspase依賴性細胞凋亡過程，導致細胞凋亡[11]。以上過程導致糖尿病大鼠海馬組織中Cyt-c表達較正常大鼠明顯增加，與實驗結果相符。本實驗結果說明，糖尿病時高血糖引起海馬組織Cyt-c表達增加，從而導致神經元細胞凋亡增加，進而導致海馬功能受損，引起認知障礙。

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