付雍,丁艷,周桃莉,歐倩怡,徐文岳

(第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部病原生物學(xué)教研室,重慶 400038)

瘧疾是全球三大傳染病之一,每年有大約80萬人死于瘧疾,其中多數(shù)是5歲以下的兒童(WHO,2010)。在5種人瘧中,惡性瘧感染是導(dǎo)致瘧疾患者死亡的主要原因。研究惡性瘧感染引起死亡的分子機(jī)制將為我們提供新的治療策略。但是,由于受倫理學(xué)的限制,重癥瘧疾許多重大機(jī)制的發(fā)現(xiàn)均來自于實(shí)驗(yàn)室鼠瘧動物模型的研究。

約氏瘧原蟲 17XNL(P.y 17XNL)是蘭多(Landau)[1]等1965年自中非共和國紅樹鼠(Thamnomys rutilans)體內(nèi)分離獲得的一種非致死株瘧原蟲,其在J.Finerty實(shí)驗(yàn)室常規(guī)傳代中突然出現(xiàn)致死克隆,并由此分離得到致死株約氏瘧原蟲17XL(P.y 17XL)[2]。但是,目前對兩種瘧原蟲感染致病機(jī)理還知之甚少,也沒有感染導(dǎo)致的組織形態(tài)學(xué)差異的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。因此,我們比較觀察了P.y 17XL和P.y 17XNL感染小鼠的原蟲率和存活率,以及感染對小鼠貧血、體重的影響和對腦部、脾臟組織結(jié)構(gòu)的損傷。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與瘧原蟲感染

約氏瘧原蟲P.y 17XL株和P.y 17XNL株為本室長期保存。SPF級BALB/c小鼠(雌性,20g)由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。實(shí)驗(yàn)分三組:正常對照組3只,P.y 17XL感染組和P.y 17XNL感染組各8只。感染組分別腹腔接種2×105個(gè)感染瘧原蟲P.y 17XL和P.y 17XNL的紅細(xì)胞。

1.2 原蟲血癥,貧血和體重觀測

從接種后第2天開始,每隔1 d稱取小鼠體重1次,并取感染小鼠尾靜脈血1滴制作薄血片,吉姆薩染色鏡檢計(jì)算原蟲率。貧血指標(biāo)為每毫升血液中紅細(xì)胞的密度。

1.3 組織病理學(xué)觀察

原蟲接種6 d后,兩感染組各隨機(jī)挑選3只小鼠,以正常組為對照,麻醉后繼以PBS和4%多聚甲醛先后灌流固定。取出小鼠腦和脾組織,4%多聚甲醛固定24 h,脫水、石蠟包埋、選擇5um厚度連續(xù)切片,HE染色,光鏡下觀察各組織形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 P.y 17XL感染引起B(yǎng)ALB/c小鼠死亡

在分別接種2×105個(gè)感染瘧原蟲紅細(xì)胞后,P.y 17XL感染組小鼠原蟲增值速度極快,在感染后4 d即達(dá)20%,6 d左右原蟲率達(dá)到80%的峰值水平,并在感染后5～9 d內(nèi)引起小鼠死亡。相比之下P.y 17XNL感染組小鼠原蟲增值緩慢,在感染后9 d左右僅15%,隨后原蟲水平逐漸下降直至被清除,小鼠得以存活。

2.2 P.y 17XL感染使小鼠體重顯著下降并引起嚴(yán)重貧血

感染后,在相同的飼養(yǎng)條件和環(huán)境中,P.y17XL感染組小鼠隨時(shí)間的推移體型明顯消瘦,從圖2A、B中可以看出小鼠的體重和紅細(xì)胞密度均呈現(xiàn)急劇下降的態(tài)勢,與圖1B相比可以發(fā)現(xiàn),P.y 17XL感染組小鼠的體重和紅細(xì)胞密度隨原蟲率的升高而急劇降低,在感染后原蟲率達(dá)到峰值的第6 d體重丟失接近10%并引起嚴(yán)重貧血。而P.y 17XNL感染組小鼠接種后前6 d原蟲增值緩慢,小鼠體重略有增重,在7-8 d時(shí)原蟲增長出現(xiàn)峰值,此時(shí)小鼠體重也相應(yīng)有所下降,隨著原蟲水平逐漸降低小鼠體重也趨于平穩(wěn)。紅細(xì)胞密度方面,P.y 17XNL感染組小鼠隨著原蟲的增值也會出現(xiàn)貧血現(xiàn)象,但在感染12 d后隨著原蟲的逐漸清除而開始恢復(fù)。

2.3 P.y 17XL感染瘧原蟲紅細(xì)胞粘附于小鼠腦部微血管

原蟲接種6 d后,腦部切片常規(guī)HE染色顯示(圖3):P.y 17XL感染組小鼠腦部毛細(xì)血管中發(fā)現(xiàn)有感染瘧原蟲紅細(xì)胞的粘附和集聚(如箭頭所示),而P.y17XNL感染組小鼠則沒有。另外在兩組感染組中沒有觀察到單核細(xì)胞在腦部微血管的浸潤。

2.4 P.y 17XL和P.y 17XNL感染對小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)的改變

脾臟是宿主抗瘧原蟲感染的主要免疫器官,感染瘧原蟲會引起脾臟組織結(jié)構(gòu)的改變,而有研究報(bào)道脾臟結(jié)構(gòu)的改變將影響宿主抗感染的免疫反應(yīng)[3],比如降低抗瘧原蟲特異抗體親和力等。我們對脾臟切片的觀察顯示(如圖4),與對照組相比,兩組感染組小鼠的脾臟都出現(xiàn)腫大的現(xiàn)象,并且P.y17XNL感染組小鼠脾腫大程度較P.y 17XL感染組小鼠更高,但是與P.y 17XNL感染組小鼠相比,P.y 17XL感染組小鼠脾臟白髓與紅髓邊界已經(jīng)模糊不清。

3 討論

重癥瘧疾嚴(yán)重危害瘧疾患者的生命安全,典型癥狀為腦型瘧,嚴(yán)重貧血和呼吸窘迫綜合征(RDS)。了解重癥瘧疾發(fā)生的分子機(jī)制將有助于發(fā)展新的瘧疾治療手段。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)約氏瘧原蟲株P(guān).y 17XL引起致死的原因可能與感染瘧原蟲紅細(xì)胞在小鼠腦部微血管的粘附以及引起感染小鼠貧血有關(guān)。此外,P.y 17XL感染還導(dǎo)致小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)的巨大改變,可能與其抑制宿主免疫反應(yīng)而促進(jìn)自身增殖有關(guān)。因此,P.y 17XL可以作為一種動物模型來研究重癥瘧疾的發(fā)病機(jī)理以及瘧原蟲的免疫逃避機(jī)制。

與P.y 17XNL不同的是,感染P.y 17XL可引起實(shí)驗(yàn)?zāi)X型瘧的發(fā)生,表現(xiàn)為感染瘧原蟲紅細(xì)胞(pRBC)在腦部微血管的粘附。另外,P.y 17XL感染引起的腦型瘧與P.bANKA有所不同,表現(xiàn)為感染瘧原蟲紅細(xì)胞在腦部微血管的粘附,但沒有炎癥細(xì)胞的集聚[4],這一點(diǎn)與惡性瘧感染更為相似。因此,這種動物模型在成熟紅細(xì)胞入侵生物學(xué),感染瘧原蟲紅細(xì)胞在腦部微血管的粘附以及對宿主抗感染免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)等方面比伯氏瘧原蟲ANKA(P.bANKA)更接近惡性瘧感染,所以這種動物模型可以用來深入研究腦型瘧發(fā)生的分子機(jī)制。

在瘧疾流行區(qū),嚴(yán)重貧血是惡性瘧感染引起的并發(fā)癥之一,也是重癥瘧疾的重要特征之一。貧血的發(fā)生不僅與感染瘧原蟲快速增殖有關(guān),而且有研究發(fā)現(xiàn)也與宿主的補(bǔ)體C3、吞噬細(xì)胞以及CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的對正常紅細(xì)胞的清除有關(guān)[5,6]。從圖1和圖2可以看出,在P.y 17XL感染時(shí),原蟲血癥快速升高的同時(shí)伴隨著紅細(xì)胞密度急劇下降,說明感染瘧原蟲紅細(xì)胞發(fā)生溶血是導(dǎo)致感染小鼠嚴(yán)重貧血的主要原因。

已知P.y 17XL和P.y 17XNL對宿主免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)存在差異,比如抗炎癥因子TGF-β的分泌時(shí)間、CD4+CD25+Treg的激活[7]以及不同的IFN-γ[8]。脾臟在抗瘧原蟲感染的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著極其重要的作用,而瘧原蟲感染將引起脾臟組織架構(gòu)的改變。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)P.y 17XL和P.y 17XNL兩者感染雖然都引起小鼠脾臟腫大,但是P.y 17XL還導(dǎo)致脾臟紅髓與白髓邊界的破壞,反映出它們對宿主免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的差異性。另外由于兩者具有高度相似的遺傳背景,還可以通過比較基因組學(xué)等方法鑒定P.y 17XL的致死成分及其機(jī)理。

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