杜麗娟 唐學(xué)貴 吳至久 李 敏

川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,四川省南充市 637000

慢傳輸型便秘的確切病因、發(fā)病機(jī)制和病理生理的改變現(xiàn)尚未完全明了,目前一系列研究表明,一些胃腸激素血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)、5-羥色胺、胃泌素、生長抑素等分泌異?？赡芘c慢性便秘的發(fā)病相關(guān)[1]。其中血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)作為胃腸動(dòng)力抑制性神經(jīng)元,具有松弛胃腸道平滑肌、抑制胃腸蠕動(dòng)的作用。因此,筆者為了解腸神經(jīng)遞質(zhì)與慢性便秘之間的關(guān)系,選取慢性便秘大鼠模型為研究對(duì)象,采用免疫組化技術(shù),檢測VIP在慢傳輸型便秘大鼠模型結(jié)腸肌間神經(jīng)叢的蛋白表達(dá)情況,探討其在慢性便秘發(fā)病機(jī)制中的作用,期望為臨床治療方案選擇提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 60只健康SD大鼠,清潔級(jí),雌雄各半,體重180～250g(川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),將動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組、慢性便秘模型組,每組30只。

1.2 動(dòng)物模型建立 參照文獻(xiàn)[2]制作大鼠慢性便秘動(dòng)物模型的方法,并加以改進(jìn),將配好的含復(fù)方地芬諾酯10mg/kg混懸液4ml灌胃,1次/d,連續(xù)灌胃14d,建立大鼠慢傳輸型便秘模型。正常對(duì)照組則以等量生理鹽水替代復(fù)方地芬諾酯進(jìn)行灌胃。

1.3 主要藥物及試劑 復(fù)方地芬諾酯(江蘇平光制藥有限責(zé)任公司);大鼠VIP一抗免疫組化試劑盒(北京博奧森生物有限公司)。

1.4 標(biāo)本制備 兩組大鼠均于末次灌胃后24h,頸椎脫臼法處死,剖腹找到盲腸,剪取近端結(jié)腸8～10mm,用4℃生理鹽水沖凈腸內(nèi)容物及血液,放入4%多聚甲醛中固定,用于免疫組織化學(xué)檢測。

1.5 結(jié)腸肌間神經(jīng)叢VIP蛋白的免疫組織化學(xué)檢測 SP法：組織石蠟切片脫臘,3%H2O2、37℃孵育,PBS沖洗,滴加10%正常山羊血清封閉液孵育,加入一抗為兔抗大鼠抗體(1∶100稀釋)孵育,PBS沖洗,滴加二抗為生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG孵育,PBS沖洗,滴加試劑辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/H RP)孵育,PBS沖洗,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,中性樹膠封片。陽性細(xì)胞胞漿呈棕褐色。

1.6 結(jié)果判定 所有切片均設(shè)置陰性對(duì)照(不加一抗染色,PBS代替一抗)。免疫組織化學(xué)陽性標(biāo)準(zhǔn)：棕褐色染色為陽性表達(dá)。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野×400,以顯微圖像分析系統(tǒng)Image-Proplus 6.0進(jìn)行圖像分析處理測定MD值。

2 結(jié)果

2.1 VIP在兩組大鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)叢表達(dá)結(jié)果主要表達(dá)于結(jié)腸肌間神經(jīng)叢神經(jīng)元細(xì)胞胞漿。VIP在正常對(duì)照組大鼠結(jié)腸黏膜層及肌間神經(jīng)叢神經(jīng)元的胞漿表達(dá)呈棕褐色,分布稀疏。與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠結(jié)腸黏膜層及肌間神經(jīng)叢神經(jīng)元表達(dá)同樣也呈棕褐色,但分布較密集,細(xì)胞陽性表達(dá)染色升高,見圖1。

圖1 正常對(duì)照組與模型組免疫組化VIP表達(dá)(×400),A：正常對(duì)照組 B：模型組

2.2 兩組大鼠MD值比較 兩組大鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)叢組織VIP蛋白檢測結(jié)果顯示,慢性便秘模型組大鼠肌間神經(jīng)叢組織V IP蛋白平均光密度值顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05),見表1。

表1 正常對(duì)照組與模型組免疫組化VIP表達(dá)平均光密度值(MD)比較()

表1 正常對(duì)照組與模型組免疫組化VIP表達(dá)平均光密度值(MD)比較()

注：*與正常對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05。

分組 例數(shù) VIP正常對(duì)照組 30 0.077±0.044模型組 30 0.223±0.025*

3 討論

慢性便秘主要是以大便排出困難、排便次數(shù)少及排便時(shí)間延長為主要癥狀,因?yàn)槠洳∫蚝桶l(fā)病機(jī)制目前尚不明確,所以臨床治療效果并不理想[3,4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)腸神經(jīng)系統(tǒng)和腸神經(jīng)遞質(zhì)參與了腸道運(yùn)動(dòng)功能的調(diào)節(jié),且逐漸成為研究慢性便秘發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)。

血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide,V IP)屬于胰高血糖素-胰泌素家族,是腸神經(jīng)系統(tǒng)中的一種主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),VIP的分泌細(xì)胞廣泛存在于整個(gè)胃腸道,其主要作用是增強(qiáng)胃腸黏膜的腺體分泌、松弛胃腸道平滑肌、抑制胃腸蠕動(dòng)。國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)V IP是胃腸道重要的神經(jīng)遞質(zhì),其分布異?？赡芘c在慢性便秘的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[5～7]。筆者研究觀察到VIP陽性表達(dá)物主要定位于肌間神經(jīng)叢神經(jīng)元的胞漿,呈棕褐色,且在慢傳輸型便秘模型大鼠的結(jié)腸肌間神經(jīng)叢中表達(dá)增強(qiáng),提示VIP與慢傳輸型便秘的發(fā)病機(jī)制相關(guān),VIP作為腸神經(jīng)系統(tǒng)抑制性神經(jīng)遞質(zhì),其水平增高可以抑制胃腸道平滑肌收縮及腸肌緊張性,減少胃腸黏膜的分泌活動(dòng),從而抑制腸蠕動(dòng)導(dǎo)致慢性便秘。故理論上可以在臨床上選用或研發(fā)能夠減少腸道VIP的釋放的藥物,降低腸道VIP水平,促進(jìn)胃腸道蠕動(dòng),從而達(dá)到治療慢性便秘的目的。

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