齊軍茹 卓秀英 楊曉泉 尹壽偉 黃立新

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640)

“大分子擁擠”是生命科學領域中的研究熱點［1］，生命細胞內含有大量的大分子物質如多糖、蛋白質、核酸等，這些大分子以很高的濃度存在，使細胞內環(huán)境變得異常擁擠，大多數(shù)的生化反應是在這種擁擠的環(huán)境體系中完成的.因此，近幾年生命科學家強烈建議把“大分子擁擠”環(huán)境與pH、離子強度和溶液組成等常規(guī)因素一樣用于研究生物大分子，加入擁擠物質逐漸成為一種研究大分子的途徑［2］.

蛋白質和多糖是共存于食品乳化體系中的最重要的兩類生物大分子，是影響食品結構和功能的主要因素.蛋白質因能在液—液或氣—液界面上形成吸附層，降低界面張力，多在膠體體系中充當乳化劑;多糖則由于其良好的增稠性和持水性而常用作穩(wěn)定劑.與以次級力結合的蛋白質－多糖體系相比，共價鍵結合的蛋白質與多糖形成大分子復合物，既保留了蛋白質的表面活性又具有多糖的親水性能，具有較高的環(huán)境適應性，其結合不受熱或pH值的影響［3］.就乳化性能而言，大分子復合物優(yōu)于某些商業(yè)小分子乳化劑［4-5］;引入糖鏈后，蛋白質的溶解度、抗氧化性、抗菌性以及熱穩(wěn)定性等性能提高［5-6］.

當體系中存在高濃度的生物大分子時，大分子之間的反應遵循分子排斥容積理論［7］，促進反應向溶質總體積減小的方向，即朝結合方向移動［8］;此外，大分子擁擠環(huán)境下蛋白質分子構型趨于穩(wěn)定，蛋白質變性程度以及聚集程度將會減?。?］.筆者前期研究了乙醇體系中大豆分離蛋白－葡聚糖共價復合物的制備及機理，結果表明乙醇通過控制水分活度對Maillard反應有促進作用［10］.基于大分子擁擠理論，文中將多糖(葡聚糖)和蛋白質(大豆分離蛋白)作為生物大分子形成高濃度的大分子擁擠環(huán)境，進行Maillard反應，探討了葡聚糖對大豆分離蛋白的共價修飾作用;與乙醇體系不同，大豆分離蛋白和葡聚糖不僅僅是反應試劑，而且是擁擠試劑.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

主要材料與試劑如下:實驗用大豆低溫脫脂豆粕，購自山東東營蛋白廠;葡聚糖(相對分子質量為60000～90000)，購自Sigma公司;無水乙醇和甲醇等試劑均為國產分析純.

1.2 儀器和設備

主要儀器和設備如下:Q100型差示掃描量熱儀，美國TA Instruments公司生產;1525型凝膠滲透色譜儀，美國Waters公司生產;MOS 450型圓二色光譜儀，法國BIO-LOGIC公司生產;Mastersizer 2000型粒度分布儀，英國Malvern Instruments公司生產.

1.3 實驗方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備

大豆分離蛋白(SPI)的制備方法見文獻［10］.

1.3.2 蛋白 －多糖干熱反應

將大豆分離蛋白與葡聚糖按質量比1∶1混合并溶解，調混合物總質量濃度至60 g/L，冷凍干燥.物料過120目篩后放置在有飽和KBr溶液的容器內，保持相對濕度為79%，在60℃下恒溫反應5d，得到干熱復合物(DHC).

1.3.3 SPI和葡聚糖的交聯(lián)

分別稱取1g大豆分離蛋白和一定量的葡聚糖，加入pH值為6.5的磷酸鹽緩沖液10 mL，攪拌2 h至完全溶解，添加0.2%NaN3數(shù)滴，置于5℃過夜;之后保持恒溫，攪拌加熱一段時間后，4℃下透析24h，于20℃在10000g離心30 min，取上清液，冷凍干燥，得到大豆分離蛋白－葡聚糖共價復合物(SDC).

1.3.4 接枝度的測定

采用鄰苯二甲醛(OPA)法［11］測定接枝度.稱取40mg的 OPA溶解于1 mL的甲醇中，分別加入2.5mL 200g/L的十二烷基磺酸鈉(SDS)、25 mL 0.1mol/L 的硼砂、100μLβ-巰基乙醇，最后用蒸餾水定容至50 mL，得到OPA試劑.取OPA試劑4 mL于試管中，分別注入200 μL樣品液，混勻后于35℃反應2min，340nm下測其吸光值.由此可得接枝度G:

式中，D0為接枝反應前溶液的吸光值，D1為接枝反應后溶液的吸光值.

1.3.5 乳化活性的測定

樣品用去離子水配制成2%(質量分數(shù))的溶液，加入含量為20%(體積分數(shù))的花生油溶液，30MPa高壓均質2次，制成乳狀液，用去離子水按質量比1∶1000稀釋，采用粒度分布儀測定乳狀液中粒子大小及其分布［12］.參數(shù)設置如下:顆粒折射率為1.520，分散劑折射率為1.330.

1.3.6 熒光光譜分析

采用1-苯胺基萘-8-磺酸鹽(ANS)熒光探針法［13］進行分析.將加熱后的糖基化產品用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)稀釋為蛋白質質量濃度為0.1 g/L的待測樣，檢測前取20 μL ANS溶液(8mmol/L)加到4mL待測液中混合均勻，激發(fā)波長為390nm(狹縫5 nm)，迅速進行400～600 nm的波長掃描.

1.3.7 其它分析方法

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、熱穩(wěn)定性測定、凝膠滲透色譜分析及圓二色光譜儀分析的具體方法參考文獻［10］.

2 結果與分析

2.1 Maillard反應條件的確定

Maillard反應中，蛋白質中的游離氨基對側鏈進行修飾，文中通過游離氨基的變化情況表征Maillard反應的程度，即接枝度.

在反應體系中，蛋白質分子有一個肽鏈展開、游離氨基暴露的過程，隨著反應的進行，游離氨基參與了羰氨反應，形成共價結合物，體系游離氨基逐漸減少，接枝度升高.當SPI/葡聚糖質量比為2∶1、1∶1、1∶2、1∶3 時，對應的接枝度分別為 20.21%、62.72%、63.19%、44.65%，接枝度隨葡聚糖濃度的升高先升高后降低.這是因為:體系越擁擠，與SPI的接觸面越大，有利于反應的進行，接枝度增大，但是同時葡聚糖的空間位阻也增加，會阻礙共價交聯(lián)的進行，過大的葡聚糖濃度會使接枝度減小.可見，SPI/葡聚糖的最佳質量比為1∶1(質量比為1∶2時所耗葡聚糖過多).當反應時間為 18、24、30、36 h時，對應的接枝度分別為44.79%、56.48%、62.70%、62.91%，可見，反應時間增加，接枝度提高，當反應時間達到30 h時，其接枝度與36 h時基本相當.在Maillard反應中，當反應溫度為 50、55、60、65℃時，對應的接枝度分別為30.73%、49.92%、62.84%、62.99%，可見，隨著反應溫度的升高，接枝度提高，當反應溫度從60℃升高到65℃時，接枝度增加不明顯.因此，可確定Maillard反應的適宜條件為:SPI/葡聚糖質量比為1∶1，反應時間為30h，反應溫度為60℃.

2.2 電泳圖譜分析

圖1為考馬斯亮藍染色和糖蛋白染色的電泳圖譜.在考馬斯亮藍染色圖譜中，SDC的條帶中分離膠與濃縮膠界面有相對分子質量較大且集中的物質生成，在上樣孔與濃縮膠界面生成了相對分子質量更大的聚集物，有大量難以進入濃縮膠的大分子物質，而未加熱和加熱的SPI條帶沒有這兩種現(xiàn)象.在糖蛋白染色圖譜中，對應考馬斯亮藍染色圖譜中的大分子區(qū)域均有聚合產物條帶，表明SDC為共價結合的糖蛋白.

圖1 考馬斯亮藍染色和糖蛋白染色的電泳圖譜Fig.1 Electrophoretograms with coomassie brilliant blue staining and carbohydrate staining

結合接枝度分析的結果可知，模擬大分子擁擠體系可以大大縮短反應時間，擁擠體系只需30 h就可完成反應，而傳統(tǒng)的干熱反應需5天.這是因為水相反應中可以自由攪拌，克服了干熱反應不均勻的缺點，最大程度地讓多糖和蛋白質充分接觸，從而加快了反應速度.這說明了模擬大分子擁擠體系進行Maillard反應的可行性和有效性.

2.3 乳化活性

圖2示出了各樣品的乳化活性.乳狀液中的粒度分布是影響乳狀液穩(wěn)定性的關鍵因素，也是評價樣品乳化活性的重要指標.乳狀液粒子越大，乳析過程越快，乳析率越高.由圖2可知:SDC的乳液粒徑小，乳化活性高，且穩(wěn)定性好;質量比為1∶1的SPI/葡聚糖混合物的乳液粒徑偏高，表明未經Maillard反應的混合物中蛋白質的乳化活性沒有得到改善;SPI單獨加熱所得產物的乳液粒徑明顯較大，說明在加熱過程中蛋白質發(fā)生了熱聚集，從而導致粒徑增大，乳化活性降低.顯然，大分子擁擠環(huán)境中，葡聚糖糖鏈的鍵入可有效抑制蛋白質的熱聚集.該現(xiàn)象表明，大分子擁擠體系中Maillard反應制備的蛋白

圖2 乳化活性的比較Fig.2 Comparison of emulsifying activity

2.4 疏水性分析

圖3為產物加熱后的外置熒光光譜.利用ANS作為熒光探針的外置熒光光譜可以分析蛋白質疏水基團暴露的情況.ANS連接到芳香族氨基酸如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的支鏈上，因而熒光強度與蛋白質的疏水性直接相關［14］，熒光強度越大，疏水性越強.由圖 3可知，熒光強度的高低順序為:SPI＞SPI/葡聚糖混合物＞SDC.這說明以共價鍵形式鍵入的葡聚糖能夠與芳香族氨基酸共價結合，減少蛋白質表面的疏水基團，降低由于疏水作用導致的蛋白質聚集.

圖3 對照樣品和SDC的外置熒光光譜Fig.3 Exterior fluorescence emission spectra of control samples and SDC

2.5 熱穩(wěn)定性分析

圖4為SDC和SPI的差示掃描量熱(DSC)圖譜.加熱是蛋白質加工中不可避免的工序，而蛋白在熱作用后會發(fā)生變化(如聚集、分子結構變化等)，因而影響其功能.由圖4可知，三者均呈現(xiàn)了一至兩個吸收峰，這是SDC和SPI的熱變性峰.其中SDC的變性溫度較高，為105.17℃，變性焓為25.600J/g，兩項指標都高于加熱和未加熱處理的SPI，表明大分子擁擠體系中，蛋白質的熱穩(wěn)定性提高了.原因可能是由于葡聚糖分子糖鏈的鍵入，分子的凈負電荷增加，空間位阻增大，靜電排斥作用增強［15］，因此接枝的復合物在熱作用下不易發(fā)生聚集［16］，熱穩(wěn)定性得到提高.

圖4 SDC和SPI的DSC圖譜Fig.4 DSC profiles of SDC and SPI

2.6 相對分子質量分析

圖5為對照樣品和SDC的凝膠滲透色譜圖，根據所測標準樣品的數(shù)據，當洗脫時間為12.97 min時，對應的相對分子質量為669000;當洗脫時間為15.83min時，對應的相對分子質量為158000;當洗脫時間為17.06 min時，對應的相對分子質量為43000.比較可知，與SPI相比，SDC的吸收峰發(fā)生明顯變化，且洗脫峰位置前移，說明生成了聚合物;相對分子質量變大，說明糖基化處理后，大分子的分散度提高，蛋白與糖交聯(lián)后其產物為各種不同相對分子質量的物質組成的混合物，其中高相對分子質量的物質較多，與2.2節(jié)中的電泳圖譜分析結果一致.

圖5 對照樣品和SDC的凝膠滲透色譜Fig.5 Gel permeation chromatograms of control samples and SDC

2.7 蛋白質二、三級結構分析

圖6(a)示出了對照樣品和SDC二級結構的變化情況.研究表明，典型的α螺旋結構蛋白在192nm處有明顯正吸收峰，在208nm及222nm處有兩個明顯負吸收峰，β折疊結構在196 nm處有一正的譜帶，在206 nm處有一負的譜帶［17］.與SPI的二級結構組成相比，兩種糖基化產物二級結構的主要結構與SPI一樣，仍以β折疊結構為主，而α螺旋含量均有不同幅度的減少，無規(guī)則卷曲含量都增加.這說明蛋白質肽鏈中引入較長的糖鏈，抑制了蛋白質分子聚集，空間結構發(fā)生變化，柔韌性有所增加［18］.與干熱產物DHC的二級結構略有不同，SDC的α螺旋結構減少的幅度較大，原因可能是水溶液更有利于反應的進行，反應程度更高，隨著葡聚糖分子的接入，空間位阻增大，α螺旋結構迅速減少，蛋白質展開逐漸趨于穩(wěn)定.

圖6 對照樣品和SDC的圓二色譜分析Fig.6 Circular dichroism spectra of control samples and SDC

對照樣品和SDC三級結構的近紫外圖譜如圖6(b)所示.圓二色譜的近紫外圖譜反映了蛋白質側鏈基團的變化，主要是芳香族氨基酸，如色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)［19］.圖6(b)中SDC圖譜變化大，曲線主要波動出現(xiàn)在250～290nm內，表明擾動主要發(fā)生在Phe、Tyr殘基及二硫鍵附近.糖鏈的接入能引進較大的空間位阻，較大程度地屏蔽掉近紫外區(qū)有信號的芳香族氨基的圓二信號，尤其在Phe的特征信號范圍250～265 nm內，圓二信號負值增強，說明在糖基化過程中苯丙氨酸減少，可能與葡聚糖發(fā)生了共價交聯(lián).結合近紫外和遠紫外圓二色譜分析可知，糖基化產物的二、三級結構都發(fā)生了明顯的變化，蛋白質結構的柔韌性有所增強，這將更有利于發(fā)揮其功能.

3 結語

文中探討了大分子擁擠體系中蛋白質糖基化的有效性，發(fā)現(xiàn)大分子擁擠體系可加速接枝反應的進程，大大縮短反應時間.電泳圖譜結果表明，接枝效果良好，所得產物具有優(yōu)異的性能，特別是乳化活性和熱穩(wěn)定性.此外，文中還從構象角度揭示了大分子擁擠體系中蛋白質糖基化產物的特性:反應體系中蛋白二級結構α螺旋含量減少，無規(guī)則卷曲含量增強，蛋白質結構的柔韌性增強，更有利于發(fā)揮其功能.SDC作為一種性能優(yōu)異的的大分子復合物在食品工業(yè)中有廣泛的應用，文中提供的SDC制備方法可為工業(yè)生產提供一定的技術基礎，有助于SDC的工業(yè)規(guī)?；a.

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