陳健 張靈芝 韋丁 徐曉飛

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640)

黑虎掌菌，學名翹鱗肉齒菌(Sarcodon imbricatus)，該菌菌體上長滿一層細茸毛，呈黃褐色，并有明顯的黑色花紋，形同虎爪，因而得名.國外主要分布于日本、德國，國內(nèi)主要分布于云南、西藏等地.我國具有長期采集食用黑虎掌菌的歷史，民間還有用它入藥的記錄［1］.黑虎掌菌在歷史上被視為名貴山珍，是歷代宮廷喜愛的貢品之一［2］.

國際上，多糖被稱為“生物應答效應物”，能增強人體的免疫功能，對腫瘤的生長有一定的抑制作用.目前最常用的體外抗腫瘤藥物篩選方法有3種，分別是四甲基偶氮唑鹽(MTT)微量酶反應比色法、四唑氮衍生物(XTT)法和磺基羅丹明B(SRB)法，其中MTT法實驗周期短，所需細胞數(shù)目較少，所得資料較準確，是藥物篩選的主要手段［3］.

目前對黑虎掌菌多糖的研究很少，特別是關于純化多糖抗腫瘤活性的研究鮮見報道.文中分析了兩種黑虎掌菌子實體純化多糖的光譜特征及單糖組成，評價了它們在體外的抗腫瘤活性，以期為黑虎掌菌子實體多糖的開發(fā)利用提供科學依據(jù).

1 實驗部分

1.1 材料及儀器

主要實驗材料如下:黑虎掌菌，購于廣州一德路干貨市場;D354FD樹脂，廣州市廣聯(lián)津化工有限公司生產(chǎn);單糖標準品葡萄糖、巖藻糖、木糖、甘露糖及半乳糖，美國Sigma公司生產(chǎn);Whatman DEAE-52，廣州展晨生物科技有限公司進口分裝;Sepharose CL-6B，美國 Pharmacia公司生產(chǎn);完全RPMI-1640培養(yǎng)基、MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒，南京凱基生物公司生產(chǎn);其它試劑均為國產(chǎn)分析純.

主要實驗儀器如下:DZTW型調(diào)溫電熱套，北京市永光明醫(yī)療儀器廠生產(chǎn);旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器生產(chǎn);721-P型分光光度計，上海現(xiàn)科儀器有限公司生產(chǎn);BT-200型恒流泵、DBS-100型自動部分收集器，上海滬西儀器廠生產(chǎn);冷凍干燥系統(tǒng)、3543型培養(yǎng)箱，美國 Thermo公司生產(chǎn);Vector 33型傅里葉變換紅外光譜儀，德國Bruck公司生產(chǎn);液相色譜系統(tǒng)，美國Waters公司生產(chǎn);氣相色譜系統(tǒng)，美國Aglient公司生產(chǎn);680型酶標儀，美國伯樂公司生產(chǎn);CK40-F200型倒置顯微鏡，日本Olympus公司生產(chǎn).

1.2 黑虎掌菌多糖的分離純化工藝

黑虎掌菌子實體干品用95%(體積分數(shù)，余同)的乙醇回流提取3次，混合物過濾，殘渣用熱水回流提取3次，混合物抽濾，濾液合并后減壓濃縮，添加無水乙醇至乙醇含量為75%，于4℃冰箱過夜，混合液于4 000 r/min離心15 min，沉淀復溶，將糖液和Sevage試劑(三氯甲烷/正丁醇體積比為5∶1)混合，兩者體積比為5∶1，震蕩20min，離心，取上部糖液添加D354FD樹脂脫色，經(jīng)過脫色的糖液透析后減壓濃縮，濃縮液過DEAE-52陰離子柱層析，收集洗脫液并濃縮，透析，之后過Sepharose CL-6B凝膠柱層析，收集洗脫液并濃縮，透析，最后冷凍干燥得到兩種多糖SIPa和SIPb.

1.3 SIPa和SIPb的相對分子質(zhì)量測定

SIPa和SIPb的均一程度和相對分子質(zhì)量用高效凝膠滲透色譜測定.樣品配制成1 g/L的水溶液，用0.45μm微孔濾膜過濾后進樣.色譜條件為:TSKGEL G-4000PWXL柱(7.8 mm×300 mm)與TSKGEL G-2500PWXL柱(7.8mm ×300mm)串聯(lián)，流動相為0.02mol/L的KH2PO4溶液，流速為0.6mL/min，柱溫為35℃.

1.4 紅外光譜分析

分別取約2 mg SIPa和 SIPb，與KBr混合研細后，在4000～400cm－1范圍內(nèi)進行紅外掃描.

1.5 單糖組成分析

多糖的水解:分別稱取10 mg SIPa和SIPb放入小管中，加2 mL 2 mol/L的三氟乙酸，充氮氣封管，110℃水解3 h.將水解液減壓蒸干，加1.5 mL甲醇溶解，再減壓蒸干，重復多次以除盡殘余的三氟乙酸.

衍生化:分別往SIPa和SIPb的水解物、單糖標準品中加入10mg鹽酸羥胺和1 mL吡啶，90℃水浴30min并振蕩，冷卻至室溫，加入醋酸酐1 mL，繼續(xù)于90℃水浴中保持30min，生成具有揮發(fā)性的糖腈乙酸酯衍生物.

氣相色譜條件:采用 Aglient 6890N氣相色譜儀、DB-1701毛細管柱(30m×0.25m×0.25μm)及氫火焰離子化檢測器;高純氮作載氣，流速為1mL/min.程序升溫:柱初始溫度為180℃，以2℃/min升至220℃，保持 1 min，以 5℃/min升至 250℃，保持2min;進樣口溫度為250℃，分流比為1∶14.5，汽化室溫度為250℃，檢測器溫度為300℃，吹掃流速為4.0mL/min.

1.6 黑虎掌菌多糖的抗腫瘤活性實驗

取對數(shù)生長期的貼壁細胞，1 000 r/min離心10min，用0.25%的胰蛋白酶溶液消化后，用10%(體積分數(shù))小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋.用玻璃滴管輕輕吹打成單細胞懸液，顯微鏡下用血細胞計數(shù)板計數(shù)，制成5×104個/mL的細胞懸液.

往96孔培養(yǎng)板中加入200μL配制好的細胞懸液，最外一層加200 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)，封口，置37℃、5%(體積分數(shù))CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h.倒掉原培養(yǎng)基，再加入180 μL培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的SIPa和SIPb水溶液20 μL，以三蒸水為溶劑對照組，以不加細胞和多糖溶液的培養(yǎng)基為空白對照組，每組5個平行樣.封口繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取出培養(yǎng)基，加PBS清洗后，每孔再加入180 μL培養(yǎng)基和20μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h.小心吸棄上清液，然后每孔加150μL二甲基亞楓，輕輕振蕩使深藍色沉淀物完全溶解，約1 h后用酶標儀測定492 nm波長下各孔吸光值，測定需減去空白對照［4］.腫瘤細胞生長抑制率計算公式為

2 結果與討論

2.1 黑虎掌菌多糖的柱層析分離純化

多糖分子一般為中性或酸性帶負電荷的大分子，因此采用陰離子交換柱層析分離黑虎掌菌多糖.

如圖1所示，黑虎掌菌多糖的DEAE-52柱層析水洗脫后得到一個峰，收集6到16管;透析后再過Sepharose CL-6B凝膠柱層析，得到兩個洗脫峰，8到16管收集后冷凍干燥得SIPa，17到28管為SIPb.

圖1 黑虎掌菌多糖的柱層析圖Fig.1 Elution patterns of polysaccharides from Sarcodon imbricatus with column chromatography

2.2 SIPa和SIPb的相對分子質(zhì)量和純度

圖2是黑虎掌菌多糖SIPa和SIPb的高效凝膠滲透色譜圖.SIPa的峰位相對分子質(zhì)量為242769，重均相對分子質(zhì)量Mw為2.12×105;SIPb的峰位相對分子質(zhì)量為10 727，重均相對分子質(zhì)量Mw為1.05 ×104.

多糖相對分子質(zhì)量多分散性程度用相對分子質(zhì)量分布指數(shù)D表示，即Mw/Mn，其中Mn為數(shù)均相對分子質(zhì)量.D=1時，是相對分子質(zhì)量均一的聚合物，D越大其相對分子質(zhì)量分布越寬，多分散性程度越大［5］.SIPa和 SIPb的D值分別為 1.25 和 1.10，表明SIPa、SIPb均為相對分子質(zhì)量分布比較集中的多糖.此外，用凝膠柱層析法分別對SIPa和 SIPb驗純，結果如圖3所示，其洗脫曲線均為單一對稱峰.高效凝膠滲透色譜法和凝膠柱層析法的檢測結果證明，SIPa和SIPb均為單一成分多糖.

圖2 SIPa和SIPb的高效凝膠滲透色譜圖Fig.2 High-performance gel permeation chromatograms of SIPa and SIPb

圖3 SIPa和SIPb的Sepharose CL-6B柱層析圖Fig.3 Elution patterns of SIPa and SIPb on Sepharose CL-6B column

2.3 SIPa和SIPb的化學結構

SIPa和SIPb的紅外吸收情況如圖4所示.由圖4可見:SIPa和SIPb在3410cm－1附近有強吸收，屬于O—H伸縮振動的特征吸收;2930 cm－1附近的弱吸收代表CH3、CH2、CH等的C—H伸縮振動;1614cm－1附近的較強吸收以及1400～1200 cm－1的弱吸收都屬于多糖的特征紅外吸收［6］.上述3種紅外吸收都是糖類的特征吸收峰，因此可確認SIPa和SIPb均為糖類化合物.此外，1300～1000 cm－1處的吸收屬于吡喃環(huán)的伸縮振動，所以SIPa和SIPb都是吡喃環(huán)結構［7］.SIPa 具有 895 cm－1處的吸收，代表 C1—H豎變角振動，表示該多糖以β型吡喃糖苷為主;在異頭碳區(qū)(950 ～700 cm－1)及 920、809 cm－1處的明顯吸收與甘露糖的存在相對應［8］，因此 SIPb含有甘露糖.

圖4 SIPa和SIPb的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra of SIPa and SIPb

2.4 SIPa和SIPb的單糖組成

菌類多糖一般是由鼠李糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等單糖組成，根據(jù)單糖組成情況可分為5類，即雜多糖、甘露聚糖、葡聚糖、糖蛋白和多糖肽［9］.對于不同種類的真菌、不同提取方法和提取部位，單糖組成會存在差別.

圖5為單糖標準品和SIPa、SIPb的糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜圖，圖5(a)中的5個峰(9.862、11.017、16.362、17.483、18.304min 處)分別表示標準巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖.圖5(b)顯示SIPa為葡聚糖，只含葡萄糖;SIPb為雜多糖，單糖組成為巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，摩爾比為8.93∶1∶4.25∶29.18.在研究比較多的菌類多糖中，類似于SIPa屬于葡聚糖的有香菇多糖、裂褶多糖，二者都具有抗腫瘤、提高細胞免疫及體液免疫的功能［10］;類似于SIPb，單糖組成中含有巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的多糖有棘托竹蓀多糖，它對小鼠肉瘤S-180具有一定的抑制作用，其平均抑制率為 38.93%［11］.

2.5 SIPa和SIPb的抗腫瘤活性

圖5 單糖標準品、SIPa和SIPb的氣相色譜圖Fig.5 Gas chromatograms of standard monosaccharide，SIPa and SIPb

多糖的抗腫瘤作用大小可能與提取方式、提取部位，以及多糖水溶液的相對分子質(zhì)量、大小、分支度、化學結構等相關.文獻［12］的結果顯示，用超聲法從側茸菌核和菌絲中提取的多糖的相對分子質(zhì)量比用熱水提取法的高，用熱水提取的多糖比用超聲法提取的抗腫瘤活性高;提取方法相同時，從側耳菌核中提取的多糖的相對分子質(zhì)量越高，抗腫瘤活性也越強.相對分子質(zhì)量適中的(5.0×105～15.0×105)香菇多糖活性比相對分子質(zhì)量很低或者很高的多糖的抗腫瘤活性都強［13］.相對于空白對照組，SIPa和SIPb對Hep G2和HO-8910細胞的增殖都有抑制作用(見表1)，濃度越高，抑制作用越明顯，呈劑量依賴性;以SIPb對HO-8910的抑制作用最為顯著，最高抑制率為28.51%.SIPb較強的抗腫瘤活性可能與其單糖組分中的甘露糖和葡萄糖有關，因為人體的巨噬細胞有一個多糖受體，該受體對葡萄糖和甘露糖有高度專一性［14］，故含有葡萄糖和甘露糖的菌類多糖可能具有抗癌活性［15］.

3 結語

文中通過水提醇沉、除蛋白、脫色、離子交換柱層析和凝膠柱層析分離純化得到兩種相對分子質(zhì)量分布比較集中的黑虎掌菌子實體多糖組分SIPa、SIPb，紅外光譜結果證明它們都是多糖類物質(zhì).單糖組成分析顯示，SIPa只含有葡萄糖，SIPb含有巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖.MTT實驗表明，SIPa和SIPb對人肝癌細胞Hep G2和人卵巢癌細胞HO-8910的增殖都有抑制效果，有進一步研究利用的價值.但對其高級結構、構效關系和藥理的研究還不夠深入，且生長環(huán)境不同、培養(yǎng)條件不同、提取分離技術不同都會造成多糖結構的差異，都會影響其活性;因此，還需要進一步準確分析黑虎掌菌多糖的結構，以充分開發(fā)利用其價值.

表1 黑虎掌菌多糖對Hep G2和HO-8910細胞增殖的抑制作用1)Table 1 Growth inhibition of cells Hep G2 and HO-8910 by SIPa and SIPb

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