楊海峰， 朱林燕， 鄭廣娟， 陳麗新， 王立偉， 林 熙， 唐慰萍

(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東省中醫(yī)院病理科，廣東 廣州 510120;暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院2藥理學(xué)系，3生理學(xué)系，廣東 廣州 510632;4廣東醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，廣東 湛江 524023)

低氧是實(shí)體瘤微環(huán)境中一個(gè)重要的病理生理學(xué)特征。當(dāng)實(shí)體瘤直徑達(dá)1－2 mm時(shí)，血液循環(huán)中的氧難以到達(dá)腫瘤中心導(dǎo)致腫瘤低氧(tumor hypoxia)［1］，而腫瘤新生血管的建立可使腫瘤低氧區(qū)域重新獲得氧的供應(yīng)(reoxygenation)。因而腫瘤微環(huán)境表現(xiàn)為周期性的低氧 －復(fù)氧(hypoxia－reoxygenation，H－R)。研究顯示:H－R可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生適應(yīng)性變化，腫瘤基因組不穩(wěn)定性增加，由此產(chǎn)生的新的腫瘤變異型甚至對低氧有更好的生存適應(yīng)能力［2，3］。鼻咽癌是一種高發(fā)于我國南方地區(qū)的惡性腫瘤，其原發(fā)瘤及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤的微環(huán)境中都有低氧的表現(xiàn)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，低氧可誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞(CNE－2Z)血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)增加［4］，這一機(jī)制可能促進(jìn)腫瘤血管生成，恢復(fù)腫瘤供氧。在此，我們通過研究CNE－2Z細(xì)胞在H－R后其增殖能力和細(xì)胞周期進(jìn)程的改變，以及H－R對細(xì)胞黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，探討微環(huán)境HR對鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性影響的規(guī)律。

材料和方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)

低分化人鼻咽細(xì)胞株CNE－2Z(本室建株并保存)培養(yǎng)于含10%新生牛血清(Gibco)、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI－1640(Gibco)培養(yǎng)液中，預(yù)先在37℃、20%O2和5%CO2(常氧)環(huán)境中培養(yǎng)24 h使細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，更換新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行低氧和復(fù)氧實(shí)驗(yàn)，并設(shè)立常氧對照組。低氧環(huán)境的建立參照文獻(xiàn)［4］:將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱獨(dú)立的密閉小室，先輸入純氮(99.99%)30 min(流量5 L/min)以置換裝置內(nèi)的殘余O2;然后輸入混合氣(95%N2、5%CO2和 ＜0.1%O2)30 min(流量 5 L/min)，使氣體達(dá)到平衡后減小混合氣流量為0.2 L/min，維持裝置內(nèi)低氧狀態(tài)。

2 MTT法檢測細(xì)胞增殖

CNE－2Z細(xì)胞以5×106/L的密度接種到96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，細(xì)胞貼壁8 h(以此時(shí)點(diǎn)A值為測量基點(diǎn))。在培養(yǎng)24 h(生長曲線第1 d)后開始低氧和復(fù)氧實(shí)驗(yàn)，并設(shè)立常氧對照組，低氧處理時(shí)間為24 h(生長曲線第2 d)。低氧實(shí)驗(yàn)處理結(jié)束后，更換新鮮培養(yǎng)液后在常氧條件下繼續(xù)復(fù)氧培養(yǎng)4 d(相當(dāng)于生長曲線第3－6 d)。在上述每個(gè)時(shí)點(diǎn)分別加入MTT，培養(yǎng) 4 h，去培養(yǎng)液，加入 DMSO 100 μL/well，輕輕振蕩5 min后，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測定570 nm波長的吸光度值。計(jì)算A比值(A比值=A570/8 h A570)，以A比值為縱座標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫座標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。

3 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期

CNE－2Z細(xì)胞進(jìn)行低氧和復(fù)氧實(shí)驗(yàn)，并設(shè)立常氧對照組，分別在低氧24 h(H組)、復(fù)氧8 h(H－R8組)和復(fù)氧24 h(H－R24組)時(shí)點(diǎn)收集細(xì)胞，碘化丙啶染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

4 同質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)

分組:常氧組(N組)，低氧組(H組)，低氧復(fù)氧6 h(H－R6)，低氧復(fù)氧12 h組(H－R12)，低氧復(fù)氧24 h組(H－R24)。制備黏附系統(tǒng):以4.0×104/well細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于5%CO2、21%O2、37℃環(huán)境中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞鋪滿孔底，不留空隙，更換新鮮培養(yǎng)液，分別予以分組中的不同處理因素。Trypsin－EDTA消化制備細(xì)胞懸液，以不含無血清的RPMI－1640洗滌1次。臺(tái)盼藍(lán)染色作活細(xì)胞計(jì)數(shù)，用無血清RPMI－1640稀釋，制備5.0×108/L的細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液按150 μL/well加入黏附系統(tǒng)，孵育4 h。以200 r/min振搖5 min。吸取培養(yǎng)孔中未黏附的細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞同質(zhì)黏附率:

5 細(xì)胞－基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)

分組同上。制備黏附系統(tǒng):Matrigel? (Becton Dickinson Labware)以無血清 RPMI－1640稀釋至100 mg/L后按50 μL/well加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于超凈工作臺(tái)過夜風(fēng)干。臨用前按100 μl/well加入無血清RPMI－1640培養(yǎng)液，室溫靜置90 min后吸去液體以去除未結(jié)合的Matrigel?。CNE－2Z細(xì)胞培養(yǎng)24 h至指數(shù)生長期，更換新鮮培養(yǎng)液，分別施加上述分組中的不同處理因素。Trypsin－EDTA消化制備細(xì)胞懸液，以不含小牛血清的RPMI－1640洗滌3次。臺(tái)盼藍(lán)染色作活細(xì)胞計(jì)數(shù)，用無血清RPMI－1640稀釋，制備4.0×108/L的細(xì)胞懸液，按100 μL/well加入黏附系統(tǒng)，置于5%CO2、37℃環(huán)境中孵育2 h;終止孵育，吸去未黏附細(xì)胞，加入100 μL/well結(jié)晶紫染液染色10 min;溫PBS洗滌4次，每次3 min;將培養(yǎng)板置于37℃干燥;加入醋酸－乙醇溶液100 μL/well，混勻后靜置10 min。酶標(biāo)儀570 nm測定吸光度值。以吸光度值大小表示細(xì)胞－基質(zhì)黏附力。

6 細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)

在實(shí)驗(yàn)前預(yù)先以稀釋的Matrigel?鋪入Transwell? (直徑6.5 mm，孔徑8.0 μm，Corning)制備體外細(xì)胞侵襲系統(tǒng)。

制備5×108/L的細(xì)胞懸液(H－R組細(xì)胞預(yù)先經(jīng)過24 h低氧及隨后進(jìn)行的24 h復(fù)氧處理)，按100 μL/well加入 Transwell?上室進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)24 h。常氧組(N)和低氧復(fù)氧組(H－R)實(shí)驗(yàn)在常氧環(huán)境中進(jìn)行，低氧組(H)實(shí)驗(yàn)在低氧環(huán)境中進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，甲醇∶丙酮(1∶1)固定10 min。以濕潤的棉簽拭去聚碳酸酯濾膜正面(靠近上室面)的細(xì)胞。常規(guī)HE染色，中性樹膠封片。顯微鏡下計(jì)數(shù)穿越人工基底膜Matrigel?，到達(dá)聚碳酸酯濾膜至反面的細(xì)胞數(shù)，每個(gè)Transwell?計(jì)數(shù)濾膜中央的5個(gè)連續(xù)高倍視野，以每視野細(xì)胞平均數(shù)代表侵襲能力。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)重復(fù)孔，重復(fù)3次。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 低氧對CNE－2Z細(xì)胞增殖的可逆性抑制作用

如圖1所示，與常氧對照組比較，低氧處理24 h(相當(dāng)于生長曲線第2 d)后，A相對值較常氧對照組低，二者比較差異顯著(P＜0.01)。復(fù)氧培養(yǎng)24 h后(相當(dāng)于生長曲線第3 d)A值較低氧處理結(jié)束時(shí)(第2 d)有所增加(P＜0.01)。在此之后(生長曲線第3－5 d)，與常氧對照組比較，低氧復(fù)氧組A值呈現(xiàn)快速升高的趨勢，表現(xiàn)為生長曲線坡度的顯著抬升，直至復(fù)氧后第5 d(生長曲線第6 d)，低氧復(fù)氧組A值與常氧對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。

Figure 1.Effect of hypoxia－reoxygenation on growth curves of CNE－2Z cells..n=18.＊＊P＜0.01 vs normoxia.圖1 低氧－復(fù)氧對CNE－2Z細(xì)胞生長曲線的影響

2 低氧－復(fù)氧對CNE－2Z細(xì)胞周期的影響

如圖2和表1所示，H－R影響了細(xì)胞周期分布。低氧處理24 h，細(xì)胞G1期比例明顯增加，達(dá)到(73.6±2.7)%，與對照組 G1期比例［(62.6 ±4.6)%］相比，差異顯著(P＜0.01)。復(fù)氧8 h，G1期細(xì)胞比例顯著下降，而S期細(xì)胞比例顯著增加，與常氧對照組和低氧處理組比較差異顯著(P＜0.01)。復(fù)氧后24 h，細(xì)胞周期的分布已經(jīng)恢復(fù)至接近正常對照組水平。流式細(xì)胞術(shù)測定H－R處理后未見明顯的凋亡峰，見圖2。

3 低氧－復(fù)氧對CNE－2Z細(xì)胞同質(zhì)黏附能力的影響

低氧處理24 h后，CNE－2Z細(xì)胞同質(zhì)黏附率為(24.17±10.39)%，低于常氧對照組的(47.99±7.41)%，差異顯著(P＜0.01)。復(fù)氧后同質(zhì)黏附能力較低氧組有顯著增加，在復(fù)氧6、12 h同質(zhì)黏附率分別為(46.68±9.08)%和(45.43±5.30)%，與低氧組比較差異均顯著(P＜0.01)，見圖3。然而與常氧對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。

Figure 2.Effect of hypoxia－reoxygenation on cell cycle of CNE －2Z cells.A:normoxia;B:hypoxia for 24 h;C:reoxygenation for 8 h;D:reoxygenation for 24 h.圖2 低氧－復(fù)氧對CNE－2Z細(xì)胞周期的影響

表1 低氧－復(fù)氧對CNE－2Z細(xì)胞系細(xì)胞周期分布的影響Table 1.Effect of hypoxia－reoxygenation on cell cycle distribution of CNE－2Z cells()

表1 低氧－復(fù)氧對CNE－2Z細(xì)胞系細(xì)胞周期分布的影響Table 1.Effect of hypoxia－reoxygenation on cell cycle distribution of CNE－2Z cells()

＊＊P ＜0.01 vs N;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs H.N:normoxia;H:hypoxia for 24 h;H－R8:reoxygenation for 8 h;H－R24:reoxygenation for 24 h.

N 8 62.6 ±4.6 12.4 ±3.1 25.0 ±4.1 H 3 73.6 ±2.7＊＊ 5.9 ±3.6＊＊ 20.8 ±5.8 H － R8 3 46.9 ±1.7＊＊## 9.1 ±1.6# 44.0 ±0.1＊＊##H － R24 4 60.6 ±3.3## 12.9 ±1.0## 26.6 ±2.6#

Figure 3.Effect of hypoxia－reoxygenation on homotypic adhesion of CNE－2Z cells..n=8.＊＊P＜0.01 vs normoxia，H－R6，H－R12 and H－R24.圖3 低氧－復(fù)氧對CNE－2Z細(xì)胞同質(zhì)黏附力的影響

4 低氧－復(fù)氧對CNE－2Z細(xì)胞細(xì)胞－基質(zhì)黏附能力的影響

如圖4所示，低氧處理組平均光密度值為0.943±0.055，稍低于常氧對照組0.973±0.042，但是二者比較無顯著差異(P＞0.05);復(fù)氧6、12、24 h組平均吸光度值分別為1.246±0.052、1.336±0.065和1.668±0.085，均高于常氧對照組，與常氧對照組比較差異顯著(P＜0.01)。復(fù)氧12 h組與復(fù)氧6 h組，復(fù)氧24 h組與復(fù)氧12 h組分別進(jìn)行兩兩比較，差異顯著(P＜0.01)。

5 低氧－復(fù)氧對CNE－2Z細(xì)胞體外侵襲能力的影響

Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，低氧處理組侵襲細(xì)胞數(shù)為(33.8±2.7)個(gè)/HPF，常氧對照組侵襲細(xì)胞數(shù)為(51.6±3.3)個(gè)/HPF，H－R組侵襲細(xì)胞數(shù)為(62.5±3.0)個(gè)/HPF，方差分析顯示組間有顯著差異(n=6，P＜0.01)。

討 論

Figure 4.Effect of hypoxia－reoxygenation on cell－matrix adhesion of CNE－2Z cells..n=15.＊＊P＜0.01 vs normoxia and hypoxia.圖4 低氧－復(fù)氧對CNE－2Z細(xì)胞－基質(zhì)黏附力的影響

Figure 5.Effect of hypoxia on invasion ability of CNE－2Z cells in vitro..n=6.A:normoxia;B:hypoxia for 24 h;C:reoxygenation for 24 h.圖5 低氧對CNE－2Z細(xì)胞侵襲能力的影響

腫瘤組織低氧是腫瘤細(xì)胞快速生長以及腫瘤新生血管在結(jié)構(gòu)和功能上紊亂的結(jié)果。在實(shí)體瘤中，腫瘤細(xì)胞的生長速度大于其營養(yǎng)血管的生長速度，受滲透能力的限制，遠(yuǎn)離血管的腫瘤細(xì)胞無法得到充足的氧供應(yīng)，表現(xiàn)為腫瘤低氧［1］。近年來低氧與腫瘤關(guān)系得到研究者的重視。一系列的研究表明，低氧可以改變腫瘤細(xì)胞低氧目的基因(hypoxia target genes)的表達(dá)［5－7］，臨床研究也證實(shí)腫瘤低氧與晚期頭頸癌癥患者的不良預(yù)后相關(guān)［8］。

有報(bào)道鼻咽癌原發(fā)瘤及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤微環(huán)境中都有低氧的表現(xiàn)，并且可能和腫瘤的分化以及腫瘤的體積增加有關(guān)［9，10］。治療前乏氧程度及其在治療中的變化與腫瘤的消退速度相關(guān)［11］。我們的前期研究表明:低氧可以誘導(dǎo)人鼻咽癌CNE－2Z細(xì)胞表達(dá)VEGF增加［4］，提示低氧可能對鼻咽癌細(xì)胞的演進(jìn)產(chǎn)生影響。為進(jìn)一步明確低氧對腫瘤細(xì)胞的影響，在本研究中，我們建立低氧和復(fù)氧處理的體外細(xì)胞培養(yǎng)模型，系統(tǒng)地研究低氧和復(fù)氧對鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。

我們的結(jié)果表明，低氧雖不利于鼻咽癌細(xì)胞生長，表現(xiàn)為細(xì)胞的增殖能力受抑制、細(xì)胞周期停滯在G1期及侵襲能力降低。然而復(fù)氧后細(xì)胞快速增殖，在復(fù)氧第5 d時(shí)A值已經(jīng)與常氧對照組相比無顯著性差異。而且從生長曲線圖上可以看出，在復(fù)氧2－4 d時(shí)，H－R組曲線斜率大于常氧對照組，表明在此期間H－R組的鼻咽癌細(xì)胞的增殖速度超過常氧對照組。細(xì)胞周期研究顯示:復(fù)氧后8 h，原來在低氧環(huán)境中阻滯于G1期的CNE－2Z細(xì)胞順利通過了細(xì)胞周期的G1/S期限制點(diǎn)，同步化進(jìn)入S期，到復(fù)氧24 h后，細(xì)胞周期的分布已經(jīng)基本恢復(fù)到常氧對照組水平。此結(jié)果提示低氧導(dǎo)致鼻咽癌細(xì)胞的G1期阻滯，這可能是腫瘤細(xì)胞對不利環(huán)境產(chǎn)生的一種適應(yīng)性變化，使鼻咽癌細(xì)胞的存活能力得以在低氧微環(huán)境保存;而復(fù)氧使鼻咽癌細(xì)胞CNE－2Z快速擺脫G1期阻滯，重新進(jìn)入正常的細(xì)胞周期循環(huán)。

我們還發(fā)現(xiàn)，H－R可能賦于鼻咽癌細(xì)胞某些有利于腫瘤惡性演進(jìn)的生物學(xué)特性。細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:低氧使鼻咽癌細(xì)胞同質(zhì)黏附力降低;復(fù)氧后細(xì)胞－基質(zhì)黏附力增加，且隨著復(fù)氧時(shí)間的延長表現(xiàn)出時(shí)間依賴模式。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)氧處理后，由于低氧而受到抑制的細(xì)胞侵襲能力得到恢復(fù)，并且較正常對照組有所升高。

侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)，在轉(zhuǎn)移的連續(xù)性步驟中，腫瘤細(xì)胞侵入血管(intravasation)、侵出血管(extravasation)和植入(colonization)目標(biāo)組織等重要步驟均與腫瘤細(xì)胞的侵襲能力相關(guān)［12］。低氧后復(fù)氧誘導(dǎo)的侵襲能力增加可能促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的過程。細(xì)胞黏附也是影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié):瘤細(xì)胞與瘤細(xì)胞之間的黏附稱為同質(zhì)黏附，同質(zhì)黏附力降低有利于瘤細(xì)胞從原發(fā)瘤部位的分離，啟動(dòng)侵襲和轉(zhuǎn)移的過程。另一方面，細(xì)胞－基質(zhì)黏附能力的增加則有利于腫瘤細(xì)胞侵入新的組織器官，完成侵襲和轉(zhuǎn)移的過程［3］。因此，我們認(rèn)為，低氧及復(fù)氧通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的黏附能力，可能促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，在低氧和復(fù)氧條件下，鼻咽癌細(xì)胞經(jīng)歷了一系列生物學(xué)特性的變化，這些變化不僅是為了在低氧微環(huán)境存活和生長，而且存在著腫瘤細(xì)胞對微環(huán)境變化的主動(dòng)性適應(yīng)過程。提示腫瘤微環(huán)境低氧一方面是腫瘤生長的不利因素，另一方面，低氧在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到一種“信號(hào)”的作用，促使腫瘤細(xì)胞自覺改變一些生物學(xué)表型，為進(jìn)一步的侵襲和轉(zhuǎn)移做準(zhǔn)備，甚至主動(dòng)性啟動(dòng)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程。

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