宋穎芳， 賴國祥△， 戚好文， 吳昌歸

(1 南京軍區(qū)福州總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，福建 福州350025;2 第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 西安710032)

氣道重塑是哮喘慢性化及嚴重化的基礎(chǔ)。在涉及氣道重塑的眾多細胞中，氣道平滑肌細胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。甾體激素1，25－二羥維生素D3［1，25－dihydroxyvitamin D3，1，25－(OH)2D3］是維生素D(vitamin D)的活性代謝產(chǎn)物，它不僅在骨骼代謝及免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，而且對細胞增殖、分化及凋亡等過程也具重要的調(diào)節(jié)作用［1］。先前研究發(fā)現(xiàn)1，25－(OH)2D3對多種正常細胞或癌細胞的增殖存在負性調(diào)節(jié)作用［2］。但迄今為止，國內(nèi)外尚無關(guān)于1，25－(OH)2D3對被動致敏的人氣道平滑肌細胞(human airway smooth muscle cells，HASMCs)調(diào)節(jié)作用的相關(guān)研究報道。本研究觀察1，25－(OH)2D3對被動致敏的HASMCs 增殖的影響，探討其在氣道重塑中的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

HASMCs 購自Sciencell。MTT 和胰蛋白酶購自Sigma。DMEM 培養(yǎng)基購于Gibco。胎牛血清購于杭州四季青生物公司。羊抗人增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)mAb 和SABC 試劑盒購于武漢博士德生物工程公司。

2 HASMCs 的培養(yǎng)

HASMCs 置于含10%胎牛血清的高糖DMEM 液，于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。

3 細胞分組

所有的實驗均需要對細胞進行同步化處理:待傳代細胞貼壁后，棄上清液，隨后將細胞隨機分成3 組:對照組、哮喘組及1，25－(OH)2D3組。對照血清及哮喘血清參照文獻予以制備［3］。用無血清的DMEM 液同步化對照組及哮喘組的細胞，而1，25－(OH)2D3組予以含1，25－(OH)2D3的無血清DMEM 液進行細胞同步化，同步化48 h 后，對照組加入含10%對照血清的DMEM 液，而哮喘組與1，25－(OH)2D3組均加入含10%哮喘血清的DMEM 液。

4 MTT 法檢測HASMCs 的增殖活性

4.1 確定1，25－(OH)2D3的最佳作用濃度 取對數(shù)生長期HASMCs 以6 ×103cells/well 接種于96 孔培養(yǎng)板內(nèi)，依上述方法分組，1，25－(OH)2D3組分4 個亞組:分別加入10－7、10－8、10－9、10－10mol/L 1，25－(OH)2D3，孵箱內(nèi)分別培養(yǎng)48 h 后向每孔加入MTT 液20 μL，繼續(xù)孵箱內(nèi)培養(yǎng)4 h 后，棄上清液，加入二甲基亞砜150 μL 振蕩10 min 后，選擇492 nm 波長用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值(A492nm值)，據(jù)此確定1，25－(OH)2D3最佳作用濃度。

4.2 繪制HASMCs 的細胞生長曲線 確定10－7mol/L 作為1，25－二羥維生素D3最佳濃度，調(diào)節(jié)細胞接種密度為8 ×103cells/well，實驗步驟基本同上，分別于血清刺激后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 及72 h 各取一塊培養(yǎng)板，檢測A492nm值，繪制細胞的生長曲線。

5 流式細胞術(shù)檢測HASMCs 的細胞周期

取對數(shù)生長期HASMCs 接種于75 mL 培養(yǎng)瓶內(nèi)，依上述方法進行分組，1，25－(OH)2D3組加入10－7mol/L 1，25－(OH)2D3，孵箱內(nèi)分別培養(yǎng)48 h 后快速胰酶消化收獲各組細胞，1 000 r/min 離心5 min，冰PBS 洗滌2 次，75%冰乙醇固定并4 ℃靜置過夜，而后按常規(guī)方法碘化吡啶染色，室溫放置30 min，用流式細胞儀檢測細胞周期，計算細胞增殖指數(shù)(proliferative index，PI)，PI =(S +G2/M)/(G0/G1+S +G2/M)×100%。

6 PCNA 免疫細胞化學染色

取對數(shù)生長期HASMCs 接種于內(nèi)置蓋玻片的24 孔培養(yǎng)板，依上述方法進行分組，1，25－(OH)2D3組加入10－7mol/L 1，25－(OH)2D3，孵箱內(nèi)分別培養(yǎng)48 h 后取出細胞爬片，PBS洗2 次，4%多聚甲醛固定，常規(guī)免疫細胞化學SABC 法染色，以羊抗人PCNA 抗體作為I 抗(1∶100 稀釋)，用PBS 代替特異性I 抗進行陰性對照。最后DAB 顯色，封片后鏡下觀察。顯微鏡下隨機選擇5 個高倍視野，每個視野計數(shù)100 個細胞，計算PCNA 陽性率(陽性細胞核數(shù)/總細胞核數(shù))。

7 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 MTT 法檢測1，25－(OH)2D3 對被動致敏HASMCs 增殖活力的影響

10－10mol/L 1，25－(OH)2D3組與哮喘組A492nm值無明顯差異(P ＞0.05);而其它濃度的1，25－(OH)2D3組A492nm值均較哮喘組明顯下降，且各濃度組間差異顯著，其中10－7mol/L 1，25－(OH)2D3組抑制作用最為明顯。故選取10－7mol/L 1，25－(OH)2D3為最佳濃度用于后續(xù)的實驗研究，見圖1。

10－7mol/L 1，25－(OH)2D3對被動致敏HASMCs 增殖的抑制作用表現(xiàn)為時間依賴性，見圖2。

2 1，25－(OH)2D3 對被動致敏HASMCs 細胞周期的影響

1，25－(OH)2D3顯著降低哮喘血清刺激后HASMCs 的PI，即明顯增加哮喘血清刺激的G0/G1期細胞比例，而相應地減少了S 及G2/M 期細胞比例，即阻止細胞由G0/G1期向S 期的轉(zhuǎn)化，見表1。

Figure 1. Inhibitory effect of 1，25－(OH)2D3 on the proliferation of passively－sensitized HASMCs. 1:control group;2:asthma group;3:10 －10 mol/L 1，25－(OH)2D3 group;4:10 －9 mol/L 1，25－(OH)2D3 group;5:10 －8 mol/L 1，25－(OH)2D3 group;6:10 －7 mol/L 1，25－(OH)2D3 group. ±s.n=8. #P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs asthma group.圖1 1，25－(OH)2D3 對被動致敏HASMCs 增殖的抑制作用

Figure 2. Growth curve of HASMCs treated with 1，25－(OH)2D3 at the concentration of 10 －7 mol/L. ±s.n=8. * P ＜0. 05 vs control group;△P ＜0. 05 vs asthma group.圖2 10 －7 mol/L 1，25－(OH)2D3 作用下的細胞生長曲線

表1 1，25－(OH)2D3 對被動致敏HASMCs 細胞周期的影響Table 1. Effect of 1，25－(OH)2D3 on cell cycle of passivelysensitized HASMCs(%. ±s.n=3)

表1 1，25－(OH)2D3 對被動致敏HASMCs 細胞周期的影響Table 1. Effect of 1，25－(OH)2D3 on cell cycle of passivelysensitized HASMCs(%. ±s.n=3)

* P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs asthma group.

Group G0/G1 S G2/M PI Control 73.87±0.80 16.47±0.69 9.67±0.73 26.13±0.87 Asthma 63.33±0.68* 20.27±1.32* 16.40±1.52* 36.93±0.94*1，25－(OH)2D3 69.30±0.62＊△14.83±0.67＊△15.87±1.29＊△ 30.75±1.62＊△

3 PCNA 免疫細胞化學染色

HASMCs 經(jīng)哮喘血清刺激48 h 后，細胞核著色呈褐色，PCNA 陽性 率 為(65. 74 ± 2. 59)%。10－7mol/L 1，25－(OH)2D3預處理HASMCs 后，細胞核著色呈棕褐色，PCNA陽性率為(54.57 ±1.72)%。而對照組細胞著色呈淺褐色，PCNA 表達率僅為(50.07 ±1.37)%，見圖3。

討 論

隨著哮喘的慢性化及嚴重化，它表現(xiàn)出了固定性氣道阻塞及激素抵抗等新特征。氣道重塑是所有這些新特征的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其特征性病理學改變是氣道平滑肌層的增厚。ASMCs 是平滑肌層主要組成部分，作為氣道重塑的關(guān)鍵性參與細胞及效應細胞，它在氣道重建中發(fā)揮著重要的作用，研發(fā)抑制氣道平滑肌細胞增殖的藥物已成為防治哮喘相關(guān)性氣道重塑的熱點之一。

抑制多種類型細胞的增殖，誘導細胞的凋亡和分化是除免疫調(diào)節(jié)作用外1，25－(OH)2D3的另一重要的骨外作用。既往研究已從體內(nèi)水平證實1，25－(OH)2D3對ASMCs 的抗增殖作用［4］，但體內(nèi)環(huán)境下的ASMCs 是一個三維的特殊細胞群體，具有獨特的微環(huán)境，在細胞－細胞、細胞－微環(huán)境之間存在著廣泛的聯(lián)系。因此體內(nèi)實驗所發(fā)現(xiàn)的1，25－(OH)2D3對ASMCs 的抗增殖作用是其直接的抑制作用還是其通過細胞之間的相互作用和信號傳遞而發(fā)揮的間接抑制作用，尚不明確。

Figure 3. Immunocytochemical staining for PCNA in HASMCs of each group (DAB staining，×100).圖3 HASMCs 的PCNA 免疫細胞化學染色

實驗首先采用MTT 法檢測在10－10－10－7mol/L 濃度范圍內(nèi)1，25－(OH)2D3對被動致敏HASMCs 增殖活力的影響。10－10mol/L 接近1，25－(OH)2D3在體內(nèi)的生理濃度［5］，從10－9mol/L 的濃度開始，1，25－(OH)2D3對HASMCs 增殖有明顯的抑制作用，且這種作用表現(xiàn)為濃度依賴性，當濃度達到10－7mol/L 時，1，25－(OH)2D3抗細胞增殖作用最強并呈現(xiàn)時間依賴性。10－6mol/L 是目前推薦的1，25－(OH)2D3發(fā)揮有效治療效應的血漿濃度(即藥理濃度)［6］，但這種治療劑量的應用易誘發(fā)機體的高鈣血癥，因此一定程度上1，25－(OH)2D3被嚴格限制了其在臨床上的應用。另有研究還發(fā)現(xiàn)10－6mol/L 1，25－(OH)2D3對SMCs 的調(diào)節(jié)作用僅稍強于10－7mol/L 1，25－(OH)2D3［7］。鑒于此考慮，本實驗并未選用10－6mol/L 這一濃度。從實驗結(jié)果可以看出10－7mol/L 1，25－(OH)2D3已能顯著抑制被動致敏HASMCs 的增殖及分泌功能，它為臨床運用低劑量1，25－(OH)2D3的可行性提供了初步的理論支持。

PCNA 又稱周期蛋白，是DNA 聚合酶δ 及細胞復制DNA的必須成分，其表達與細胞增殖活性有關(guān)，已成為評價細胞增殖狀態(tài)的一項客觀指標［8］。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)1，25－(OH)2D3組HASMCs 的PCNA 陽性率明顯低于哮喘組，間接證實1，25－(OH)2D3的干預能顯著抑制被動致敏HASMCs的細胞增殖，此結(jié)果與上述的MTT 法觀察結(jié)果相一致。

細胞周期是細胞增殖信號轉(zhuǎn)導的最終共同通路，進入細胞周期和細胞周期的推進是哮喘ASMCs 增殖的關(guān)鍵事件?，F(xiàn)有資料表明1，25－(OH)2D3具有特異性細胞周期抑制作用，能特異性阻斷癌細胞由G1期向S 期的轉(zhuǎn)化［9，10］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)1，25－(OH)2D3對HASMCs 的細胞周期也具有同樣的特異性抑制作用，它能阻滯細胞周期從G1期進入S 期，引起G0/G1期細胞堆積，造成處于增殖狀態(tài)的S 期及G2/M期細胞數(shù)目下降，進而抑制被動致敏HASMCs 的細胞增殖。

1，25－(OH)2D3主要通過與其受體VDR 的結(jié)合發(fā)揮生物學效應。新近研究證實VDR 基因是哮喘的新易感基因，提示1，25－(OH)2D3可通過與VDR 的配體－受體效應參與對哮喘的調(diào)節(jié)作用［11］。大量的流行病學、臨床學及免疫學資料已證實1，25－(OH)2D3在哮喘的免疫應答及慢性氣道炎癥方面均發(fā)揮著復雜的調(diào)控作用［12－14］，本研究采用被動致敏技術(shù)，發(fā)現(xiàn)1，25－(OH)2D3對哮喘狀態(tài)下HASMCs 增殖的負性調(diào)節(jié)作用，間接證實了其對哮喘氣道重塑的抑制作用。新近臨床研究發(fā)現(xiàn)機體的維生素D 水平與肺功能呈正相關(guān)［15］，本研究結(jié)果亦從細胞及分子水平為其提供了一個可能的合理性解釋，展示了1，25－(OH)2D3潛在的改善肺功能及氣道重塑的能力。

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