陳建蘭，李慶山△，王漢平，應(yīng) 逸，杜慶華，許艷麗，陳曉燕，謝健晉，毛 平，李志鵬

(1廣州醫(yī)學(xué)院附屬市一人民醫(yī)院血液科，廣東 廣州 510180;2廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子診斷學(xué)實驗室，福建 廈門 361005)

在急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)分層治療的研究中，F(xiàn)ms樣酪氨酸激酶3(Fms-like tyrosine kinase 3，F(xiàn)LT3)基因近膜區(qū)的內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)(internal tandem duplication，ITD)是最早被識別的分子標記之一，其存在與否被認為對AML的預(yù)后具有重要的判斷價值。有研究認為[1，2]，F(xiàn)LT3-ITD的這種預(yù)測價值與突變等位基因的比例有關(guān)，疾病復(fù)發(fā)率(relapse rate，RR)、無病生存率(disease-free survival，DFS)和總體生存期(overall survival，OS)隨著突變比例的升高均有惡化趨勢，且高白細胞也在高突變比例中更加突出，高比例突變的FLT3-ITD預(yù)測價值顯得更大，因而定量分析FLT3-ITD尤為重要。通常情況下由于毛細管電泳法(capillary electrophoresis，CE)的高效性和高敏感性，F(xiàn)LT3-ITD相對定量分析主要是采用此法[3]。變性高效液相色譜技術(shù)(denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLC)已經(jīng)用于檢測慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)ABL激酶區(qū)點突變[4]，且技術(shù)方法穩(wěn)定可靠，而少見DHPLC用于檢測FLT3-ITD，故我們嘗試運用DHPLC技術(shù)建立相對定量檢測FLT3-ITD突變比例的方法，對121例臨床病例進行檢測，并與CE分析結(jié)果進行了比較，最后對比測序結(jié)果。

材料和方法

1 材料

1.1 研究對象 為患者，共121例，其中40例來自2007年1月-2010年12月我院住院或門診初治經(jīng)細胞形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)染色及流式細胞術(shù)免疫學(xué)分型并參照《血液病診斷及療效標準》[5]確診為原發(fā)性 AML病例，其余81例來自2007年1月-2010年12月廈門大學(xué)中山醫(yī)院與第一附屬醫(yī)院的住院或門診初治同上確診為AML病例，由廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子診斷學(xué)實驗室提供。其中M111例，M235例，M335例，M49例，M526例，M64例，M71例;男59例，女62例;中位年齡35(16-77)歲。陰性對照為10例健康人群。

1.2 主要試劑 EZHighTMDNA kit購自Texas BioGene。5×buffer溶液(含 2.5 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/L Mg2+)和無RNase H2O均購自TaKaRa大連寶生物工程有限公司;10×LCGreen plus dye、Hotstart polymerase均為 Qiagen產(chǎn)品;FLT3-ITD正反向引物參照NCBI設(shè)計，由TaKaRa大連寶生物工程有限公司合成。DHPLC流動液:三乙胺乙酰鹽(TEAA)和乙腈(ACN)均購自Transgenomic。

2 方法

2.1 基因組DNA提取 原保存的固定后的骨髓樣本用EZHighTMDNA kit提取樣本DNA，具體操作步驟按試劑盒說明進行。采用紫外分光光度計測定A260/A280值確定DNA產(chǎn)物的濃度。將提取的DNA置于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PCR擴增 針對FLT3-ITD突變主要發(fā)生在14號外顯子上，設(shè)計擴增片段長度為328 bp，正向引物5'-AGC AAT TTA GGT ATG AAA GCC AGC TA-3'，反向引物 5'-GGT TGC CGT CAA AAT GCT GAA AG-3'。反應(yīng)體系組成為:5× buffer 5.0 μL;正向引物(10 μmol/L):0.5 μL;反向引物(10 μmol/L):0.5 μL;Hotstart polymerase 1.0 μL，DNA 2.0 μL(根據(jù)濃度調(diào)到50-100 ng);加無RNA酶水至體積25 μL。上ABI Veriti PCR擴增儀，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72℃ 1 min，循環(huán)29次。72 ℃延伸7 min，1個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物置95℃變性5 min，然后降溫至25℃ 1 min，這時混合樣品中就會形成同源和異源的雙鏈。

2.3 DHPLC分析 上WAVE 3500型分析儀前先配流動液:Buffer A液(0.1 mol/L TEAA):50 mL 2 mmol/L TEAA+250 μL ACN(乙腈)再加HPLC純水定容至1 L。Buffer B液(0.1 mol/L TEAA，含25%ACN):50 mL 2 mmol/L TEAA+250 mL ACN再加HPLC純水定容至1 L。將變性后的PCR產(chǎn)物放入到WAVE 3500型分析儀96孔樣品池上，在50℃的條件下分析待測樣本。根據(jù)程序指令，進樣器自動吸取15 μL PCR產(chǎn)物，注人DNASep分離柱內(nèi)，被流動相以0.9 mL/min的流速進行洗脫，在260 nm波長處讀取吸光度(A)值。經(jīng)系統(tǒng)自動處理后，形成DHPLC峰形圖譜，結(jié)果被自動存儲，供分析鑒定。每個樣品重復(fù)3次實驗。

正常人基因組和FLT3-ITD野生型標本DHPLC分析時表現(xiàn)為單1洗脫峰，突變型樣本則表現(xiàn)為2個或3個洗脫峰。與標準參考模板對比，通過觀察異源雙鏈洗脫峰出現(xiàn)與否，確定突變存在的情況;然后通過對洗脫峰的峰面積進行計算，獲得突變等位基因的比例，計算公式:

2.4 CE方法分析 在廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子診斷學(xué)實驗室完成，首先也是針對FLT3-ITD基因突變多發(fā)生在14外顯子上設(shè)計引物，設(shè)計擴增片段為367 bp。摸索反應(yīng)體系和反應(yīng)條件后進行PCR擴增，摸索反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，25 μL 反應(yīng)體系含5 μL 10 ×PCR buffer(100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2)，0.2 mmol/L dNTPs，1 U Taq HS DNA聚合酶，正反向引物(各自均為150 nmol/L)和5 μL gDNA模板。在T3 Thermocycler上進行PCR擴增，程序如下:95℃預(yù)變性3 min;18個循環(huán)的Touchdown PCR，程序為95℃ 30 s，61℃ 30 s(每個循環(huán)下降0.5℃)，72℃ 40 s;17個循環(huán)的普通PCR，程序為95℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 40 s;72℃ 7 min。

后取1 μL PCR產(chǎn)物(用去離子水稀釋50-200倍)、16.5 μL去離子甲酰胺(SLS)、2.5 μL 熒光標記的分子量標準(CEQ 600 size standard mixture，Beckman Coulter，p/n 608095，用SLS稀釋10倍)混勻后，轉(zhuǎn)移到96孔加樣板，并滴加1滴石蠟油防止揮發(fā)。在CEQ8800遺傳分析系統(tǒng)上，采用“Frag-2”程序運行，程序進行自動化操作。實驗結(jié)束后，根據(jù)儀器自帶軟件進行“Fragment Analysis”，對毛細管電泳結(jié)果進行片段分析，確定是否存在FLT3-ITD突變。正常人基因組DNA標本和野生型PCR擴增產(chǎn)物在367 bp處出現(xiàn)單個尖峰。突變型標本除在367 bp處出現(xiàn)單峰外，在367 bp后將出現(xiàn)另一峰，根據(jù)軟件給出的野生型峰面積S1和突變型峰面積S2，按照以下公式來計算突變比例，計算公式:

FLT3-ITD突變比例(%)=S2/(S1+S2)×100%。

2.5 DNA測序 將所有樣品DNA送北京六合華大基因科技有限公司擴增后測序驗證;再將測序結(jié)果利用DNAMAN軟件分析并與NCBI網(wǎng)上的FLT3基因進行比對確定基因突變情況;最后與2種方法檢測結(jié)果對比。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組計量資料均數(shù)比較采用隨機配對設(shè)計資料t檢驗，假定差值服從正態(tài)分布。

結(jié) 果

1 AML患者DHPLC分析結(jié)果

121例患者樣本中有108例樣本擴增后進行分析出現(xiàn)單1洗脫峰，為FLT3-ITD野生型，121例中(4號、5號、7號、8號、11號、14號、28 號、79號、85號、93號、107號、110號和118號)有2個或3個洗脫峰，即為FLT3-ITD突變型的樣本，見圖1，總陽性率為13/121(10.7%)。根據(jù)以上所述對應(yīng)的公式計算出陽性樣本的突變比例。每例陽性樣本3次實驗所得突變比例間無顯著差異，取平均值。得出13例陽性樣本突變等位基因的比例不一，分布范圍中位數(shù)34.0%(12.4%-87.0%)，見表1。正常對照的10例健康人群PCR產(chǎn)物的DHPLC洗脫峰也全為單1峰。

2 AML患者CE分析結(jié)果

正常對照健康成人DNA標本進行CE的片段分析結(jié)果在367 bp處出現(xiàn)單個尖峰。121例AML標本中108例在367 bp處出現(xiàn)單個尖峰，為FLT3-ITD野生型;13例除367 bp處峰之外在367 bp后出現(xiàn)額外峰，為FLT3-ITD突變型(見121例樣本中4號、5號、7號、8號、11號、14號、28號、79號、85號，93號、107號、110號和 118號)，見圖 2，總陽性率為13/121(10.7%)。根據(jù)以上所述對應(yīng)的公式計算出陽性樣本的突變比例。每例陽性樣本重復(fù)3次實驗所得突變比例間無顯著差異，取平均值。13例陽性樣本間比較突變等位基因的比例不一，分布范圍中位數(shù)為34.5%(11.4%-80.2%)，見表1。

Figure1.The DHPLC characteristic elution peaks.From top to bottom:represent sample of wildtype FLT3-ITD;the 28th sample:FLT3-ITD mutation in the low percentage(12.4%);the 8th sample:FLT3-ITD mutation in the moderate percentage(42.3%);the 7th sample:FLT3-ITD mutation in the high proportion(87.0%).圖1 DHPLC的特征性洗脫峰

表1 DHPLC和CE定量分析FLT3-ITD突變陽性樣本的結(jié)果對比Table1.The quantitative analysis of FLT3-ITD mutation in positive samples examined with DHPLC and CE methods(%.the average for three repeative experiments)

3 2種方法結(jié)果對比

2種方法陽性定性結(jié)果吻合，陽性率是一樣的。2種方法陽性定量結(jié)果之間比較也無顯著差異(P＞0.05)。

參照文獻[1]，我們將突變比例分成3組。低突變 (＜25%)有5例，中突變(≥25%且≤50%)有5例，高突變 (＞50%)有3例。

4 測序驗證

將所得樣品進行了測序驗證，發(fā)現(xiàn)4號、5號、7號、8號、11號、14號，28號、79號、85號，93號、107號、110號和 118號樣品為單個串聯(lián)重復(fù)突變，插入片段大小為21-87 bp不等，均為單個插入片段。結(jié)果與DHPLC、CE檢測到的陽性結(jié)果吻合。其余108例為FLT3-ITD陰性。

討 論

AML分層治療是近年來研究的熱點，染色體核型異常的AML病例可按照WHO的標準進行分層管理，而占原發(fā)病例40%-50%的核型正常的中間型病例具有高度異質(zhì)性，目前尚缺乏足夠分子標記對其進行精細的分層管理和準確的預(yù)后判斷[6]。作為最早被發(fā)現(xiàn)具有不良預(yù)后判斷價值的的分子指標之一，F(xiàn)LT3-ITD的研究最為廣泛，早幾年國內(nèi)外針對FLT3-ITD定性研究較多。尹列芬等[7]已用DHPLC技術(shù)定性檢測了60例AML患者FLT3-ITD基因突變情況，認為FLT3-ITD基因突變可作為預(yù)測AML預(yù)后的一個指標。而目前這種預(yù)測價值探索深入化，有些研究者認為FLT3-ITD等位基因突變水平的不同，預(yù)后也不同;比尹列芬他們單純的定性研究更具有預(yù)后判斷價值。比如有一項采用CE的方法[1]的研究以FLT3-ITD突變等位基因水平和FLT3-ITD存在與否作為分組指標，比較分析了2組病例RR、DFS和OS，顯示前者的預(yù)測作用明顯強于后者，差異極顯著:隨著FLT3-ITD突變比例的增加，患者的RR也隨之增加，DFS和OS降低，預(yù)后則變差;低突變水平(﹤25%)患者的預(yù)后較野生型患者差，中度突變水平(25%-50%)患者的預(yù)后又較低突變水平患者差，高度突變水平(﹥50%)患者的預(yù)后最差。Bullinger等[8]研究提示對FLT3-ITD突變等位基因進行定量分析，有可能對AML進行更精細的治療分層和更準確的預(yù)后判斷。不過Thiede等[2]則認為，F(xiàn)LT3-ITD低突變水平患者的預(yù)后與野生型患者相比并無差別，只有高水平的FLT3-ITD突變才具有預(yù)后判斷價值。

Figure2.The analysis result of one sample using CE method.圖2 某一樣品的CE方法分析結(jié)果

所以定量檢測FLT3-ITD對日后詳細判斷正常核型AML患者預(yù)后及指導(dǎo)治療具有更重要的意義。但是目前多用上述的CE方法進行檢測，該方法對儀器設(shè)備要求高或技術(shù)方法上繁瑣耗時長，不利于快速判斷，為進一步探討FLT3-ITD突變等位基因水平的臨床價值，我們根據(jù)自身實驗條件，在DHPLC定性檢測基因突變功能的基礎(chǔ)上對FLT3-ITD突變等位基因進行定量檢測。它是一項敏感可靠的DNA分析技術(shù)[9]。FLT3-ITD基因突變運用該法的檢測是基于異源雙鏈的形成，根據(jù)PCR產(chǎn)物變性復(fù)性后，形成了同源雙鏈和異源雙鏈，而異源雙鏈由于堿基對不匹配，在部分變性的溫度條件下，會在不匹配的堿基對處形成部分解鏈。由于單鏈DNA帶負電荷減少，結(jié)合力弱，因此，異源雙鏈比同源雙鏈先洗脫出來。根據(jù)其在柱子上保留時間的不同，可將同源雙鏈和異源雙鏈分離。如此就可分離檢測出由于ITD的插入而引起的FLT3基因長度多態(tài)性，再通過對洗脫峰面積的計算，對FLT3-ITD突變等位基因即可進行定量分析。

應(yīng)用該方法，我們成功地對121例AML樣本進行了檢測分析，對13例突變陽性的樣本進行了定量計算。為驗證DHPLC定量結(jié)果的準確性，我們采用CE的方法對樣本重復(fù)進行了分析。從表1可知，2種方法定量的結(jié)果完全一致(P＞0.05)，表明本研究的DHPLC定量檢測方法準確可靠、穩(wěn)定。而本組的研究群體中，F(xiàn)LT3-ITD突變的陽性率只有10.7%(13/121)，遠低于文獻報道的AML中20%-30%的陽性檢出率，正常核型AML中30%-40%[9]。而這較低的陽性率可能與樣本數(shù)量有限、地域分布局限性有關(guān)。而且，目前有研究認為FLT3-ITD定量結(jié)果不同，預(yù)后比較有顯著差異，當(dāng)然，這有待我們后續(xù)進一步研究。

與以往多數(shù)采用的CE方法檢測FLT3基因突變情況相比，DHPLC除具有同CE方法一樣快速、高重復(fù)性、自動化、準確的優(yōu)點外，且具有高通量、快捷、成本相對低的特點[10]。它不需要熒光標記的引物，也不需要任何PCR純化，簡化了操作步驟。經(jīng)我們對比觀察，DHPLC方法檢測1個樣品所花時間不足CE方法的一半，而我們的研究又證實DHPLC的結(jié)果與CE的結(jié)果一致，更進一步證實了DHPLC方法的可行性和實效性。雖然突變比例極高時該法不如CE精確，但計算軟件中的切割峰功能能使計算結(jié)果達到較高精確性，且并不影響對高突變比例樣本界限的判定。

綜上所述，建立DHPLC技術(shù)相對定量檢測FLT3-ITD突變情況，能為急性髓細胞白血病臨床治療與預(yù)后提供了更詳盡的參考指標。

[1]Gale RE，Green C，Allen C，et al.The impact of FLT3 internal tandem duplication mutant level，number，size，and interaction with NPM mutations in a large cohort of young adult patients with acute myeloid leukemia[J].Blood，2008，111(5):2776-2784.

[2]Thiede C，Steudel C，Mohr B，et al.Analysis of FLT3-activating mutations in 979 patients with acute myelogenous leukemia:association with FAB subtypes and identification of subgroups with poor prognosis[J].Blood，2002，99(12):4326-4335.

[3]Noguera NI，Ammatuna E，Zangrilli D，et al.Simultaneous detection of NPM1 and FLT3-ITD mutations by capillary electrophoresis in acute myeloid leukemia[J].Leukemia，2005，19(8):1479-1482.

[4]秦效英，秦亞溱，劉艷榮，等.應(yīng)用變性高效液相色譜檢測伊馬替尼治療后慢性髓性白血病患者ABL激酶區(qū)點突變[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2006，29(11):991-995.

[5]張之南，沈 悌.血液病診斷及療效標準[M].第3版.北京:科學(xué)出版社，2007.106-116.

[6]Schnittger S，Schoch C，Dugas M，et al.Analysis of FLT3length mutations in 1003 patients with acute myeloid leukemia:correlation to cytogenetics，F(xiàn)AB subtype and prognosis in the AMLCG Study and usefulness as a marker for the detection of minmal residual disease [J].Blood，2002，100(1):59-66.

[7]尹列芬，王 曄，姚 錦，等.急性髓細胞白血病FLT3-ITD基因突變的檢測及其臨床意義[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2009，30(4):453-455.

[8]Bullinger L，D?hner K，Kranz R，et al.An FLT3 geneexpression signature predicts clinical outcome in normal karyotype AML[J].Blood，2008，111(9):4490-4495.

[9]Jiang A，Jiang H，Brandwein J，et al.Prognostic factors in normal karyotype acute myeloid leukemia in the absence of the FLT3-ITD mutation[J].Leuk Res，2011，35(4):492-498.

[10]李 莉，王 翀，陳瑤生.DHPLC系統(tǒng)工作原理及其應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報，2006(S1):120-124.