胡志娟 郭 嵐 史亞男 董春霞 賈曉梅 劉 冰 牛 凱

(河北省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 石家莊 050051)

腎間質(zhì)纖維化(RIF)是導(dǎo)致各種腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎衰竭的共同通路。大量的研究均證實(shí)腎小管-間質(zhì)的損害程度與慢性腎臟疾病(CKD)患者的腎功能損害程度呈正相關(guān)〔1〕。在各種病因?qū)е碌哪I臟損傷過程中，氧化應(yīng)激起到重要的作用〔2～4〕。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是公認(rèn)的致纖維化因子。本研究采用大鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化模型，觀察UUO模型氧化應(yīng)激指標(biāo)及TGF-β1的變化，探討氧化應(yīng)激在腎間質(zhì)纖維化形成過程的作用，以及藥物對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠腎功能的影響和作用機(jī)制，為腎間質(zhì)纖維化的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立與分組 健康雄性SD大鼠24只(由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物室提供)，體重150～180 g，隨機(jī)分成4組:(1)正常對(duì)照組(n=6);(2)假手術(shù)組(n=6);(3)手術(shù)組(UUO組，n=6);(4)尿毒清組(n=6)。大鼠用硫噴妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，大鼠腹部正中偏左縱切口2 cm打開腹腔，暴露左腎，鈍性分離左輸尿管，于靠近腎盂段處行左輸尿管結(jié)扎后縫合腹腔;假手術(shù)組打開大鼠腹腔后僅分離左輸尿管，不結(jié)扎。模型建立后第二天起，每日早上8:00予用藥組尿毒清顆粒(廣州康臣生產(chǎn))50 mg/kg灌胃(溶于注射用水);其余組予等量注射用水灌胃。術(shù)后14 d處死大鼠，觀察結(jié)果。

1.2 生化測定 大鼠處死時(shí)以3%水合氯醛腹腔注射麻醉各組大鼠，心臟取血標(biāo)本約3 ml。血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)的測定在Beckman全自動(dòng)生化分析儀上完成。

1.3 總超氧化物歧化酶(T-SOD)和丙二醛(MDA)含量測定

黃嘌呤氧化酶法測定左腎組織T-SOD活力、硫代巴比妥酸(TBA)法測定左腎組織MDA含量。試劑盒為上海朗頓產(chǎn)品。

1.4 TGF-β1的 RT-PCR分析 均采用 TRIzol(Invitrogen公司)試劑一步抽提總RNA，再逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(逆轉(zhuǎn)錄酶AMVRT購自美國Promega公司)。以適量cDNA為模板，在TaqDNA聚合酶(Promega公司)催化下行PCR，引物由上海生物工程公司合成。actin:正鏈5'-GCC ATG TAC GTA GCC ATC CA-3'，負(fù)鏈5'-GAA CCG CTC ATT GCC GAT AG-3';擴(kuò)增條件為95℃5 min，然后95℃45 s，55℃45 s，72℃45 s(35 個(gè)循環(huán))，72℃延伸5 min;擴(kuò)增目的片段長度為375 bp。TGF-β1:正鏈5'-CTT CAG CTC CAC AGA GAA GAA CTG C-3'，負(fù)鏈5'-CAC GAT CAT GTT GGA CAA CTG CTC C-3';擴(kuò)增條件為 94℃2 min，然后 94℃30 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s(27 個(gè)循環(huán))，72℃延伸 5 min;擴(kuò)增目的片段長度為298 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5 μg/ml溴乙啶)，再用UVP凝膠圖像成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，以待檢測指標(biāo)與actin吸光度比值來表示其相對(duì)含量(目的基因相對(duì)表達(dá)量=目的基因條帶吸光度/actin基因條帶吸光度)。

1.5 腎組織病理 經(jīng)4%多聚甲醛固定腎組織石蠟包埋，制成4 μm厚切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化行HE染色。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 肉眼觀察，假手術(shù)組腎臟大小形態(tài)正常，顏色暗紅;UUO組梗阻側(cè)腎臟腫大，顏色變淺，有囊性感，內(nèi)含褐色混濁尿液，腎實(shí)質(zhì)變薄，尿毒清組介于二者之間。

圖1 TGF-β1 mRNA在四組大鼠腎組織的表達(dá)

2.2 各組BUN、Scr、T-SOD活力及MDA含量 與假手術(shù)組比較，UUO組BUN、Scr升高(P＜0.05)，腎組織勻漿中MDA含量增加(P＜0.05)、T-SOD活性降低(P＜0.05)，尿毒清治療后以上指標(biāo)明顯好轉(zhuǎn)(P＜0.05)。見表1。

2.3 各組TGF-β1 mRNA的表達(dá) 與假手術(shù)組比較，UUO組TGF-β1 mRNA的表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，尿毒清治療后TGF-β1mRNA的表達(dá)下調(diào)(P＜0.01)。見表1，圖1。

2.4 腎臟病理改變 光鏡下可見(HE染色)UUO組大鼠腎間質(zhì)炎細(xì)胞彌漫性浸潤，局灶性加重，腎小管明顯擴(kuò)張，小管內(nèi)見大量細(xì)胞管型，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，空泡變性，腎小球、小血管未見明顯病變;尿毒清組腎間質(zhì)炎細(xì)胞多灶性浸潤，部分小管擴(kuò)張、上皮細(xì)胞腫脹，空泡變性。見圖2。

表1 各組大鼠腎功能、T-SOD活力、MDA含量及TGF-β1 mRNA表達(dá)比較(± s，n=6)

表1 各組大鼠腎功能、T-SOD活力、MDA含量及TGF-β1 mRNA表達(dá)比較(± s，n=6)

與假手術(shù)組比:1)P＜0.05;與手術(shù)組比:2)P＜0.05

組別 BUN(mmol/L) Scr(μmol/L) T-SOD(U/mg) MDA(nmol/mg) TGF-β1 mRNA正常對(duì)照組 3.88±1.59 52.10±10.52 260.62±50.89 1.82±0.41 0.198±0.035假手術(shù)組 3.92±1.61 54.25±11.21 255.48±54.17 1.85±0.32 0.201±0.004 UUO組 10.90±1.721) 88.54±12.7481) 125.04±40.791) 3.98±0.791) 0.775±0.0141)尿毒清組 6.50±1.581)2) 72.10±14.661)2) 187.27±40.791)2) 2.75±0.651)2) 0.519±0.0291)2)F值 24.76 11.40 11.70 18.13 818.36 P值0.000 0 0.000 1 0.000 1 0.000 0 0.000 0

圖2 各組大鼠腎組織HE染色結(jié)果(×100)

3 討論

目前認(rèn)為，腎間質(zhì)纖維化是各種炎癥和非炎癥性腎臟疾病進(jìn)展的最終結(jié)局，是所有慢性進(jìn)行性腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎衰竭的共同形態(tài)學(xué)特點(diǎn)〔5，6〕。UUO是目前常用的腎小管間質(zhì)損傷模型之一，是主要累及腎小管間質(zhì)的非免疫源性進(jìn)行性腎損害的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。持續(xù)輸尿管梗阻導(dǎo)致腎小管擴(kuò)張和腎間質(zhì)缺血，引起腎小管上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，繼而出現(xiàn)以單核、淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤，腎小管上皮細(xì)胞數(shù)量減少和間質(zhì)纖維組織增生，進(jìn)而發(fā)展為小管萎縮和間質(zhì)纖維化〔7〕。

目前研究認(rèn)為，TGF-β1在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)中起重要作用，是主要的致纖維化因子之一。主要表現(xiàn)在:①促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成，可促進(jìn)多種ECM成分如Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型膠原和多種蛋白多糖的生成，抑制降解ECM成分的酶的合成，同時(shí)促進(jìn)整合素表達(dá)而增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)相互作用。②TGF-β1通過自分泌和旁分泌方式作用于成纖維細(xì)胞和單核細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞因子的表達(dá)分泌，從而促進(jìn)纖維化進(jìn)程〔8，9〕。本實(shí)驗(yàn)顯示梗阻腎間質(zhì)TGF-β1的表達(dá)明顯增多，表明TGF-β1的高水平表達(dá)加速間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致細(xì)胞損傷、衰老和死亡的主要原因之一，在心血管疾病、肝肺纖維化、神經(jīng)退行性疾病和癲癇等重要疾病中也扮演著重要角色。腎組織需要較高的氧耗來完成水和電解質(zhì)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)和重吸收，所以腎小管易受到氧化損傷。研究表明腎臟缺血再灌注損傷和順鉑細(xì)胞毒均可引起腎間質(zhì)內(nèi)氧化應(yīng)激得增加〔10〕。目前認(rèn)為，UUO模型腎臟病理損傷與腎缺血、低氧、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、轉(zhuǎn)化生長因子 β1(TGF-β1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、活性氧(ROS)產(chǎn)物誘發(fā)的損傷有關(guān)。脂質(zhì)過氧化是指在自由基的攻擊下不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)，從而生成一系列活性氧的復(fù)雜過程。脂質(zhì)過氧化使膜完整性破壞，引發(fā)細(xì)胞周圍炎癥;MDA是在氧自由基作用下發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的一種產(chǎn)物，其本身也能破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能，對(duì)細(xì)胞具有毒性，并能刺激間質(zhì)細(xì)胞膠原基因表達(dá)，MDA量的變化提示體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，間接反映細(xì)胞損傷的程度。SOD能清除超氧化物陰離子，可拮抗脂質(zhì)過氧化，其活力的高低可間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力。

尿毒清顆粒由大黃、黃芪、甘草、茯苓、川芎、丹參、白術(shù)、制何首烏、姜半夏等組成，具有扶正益氣、祛濁解毒、化瘀生新作用。尿毒清顆粒作為中藥復(fù)方制劑，具有多因素、多靶點(diǎn)、綜合表現(xiàn)藥效的特點(diǎn)。主要成分大黃具有抑制細(xì)胞因子、生長因子生成，抑制腎小球系膜細(xì)胞增生及成纖維細(xì)胞的增殖作用。

本試驗(yàn)結(jié)果表明在UUO模型腎小管間質(zhì)病變中氧化應(yīng)激增加，尿毒清治療后氧化應(yīng)激指標(biāo)下調(diào)，腎間質(zhì)纖維化減輕。氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)物的增加可能在UUO模型腎小管間質(zhì)病變中有重要的作用。因此，在慢性腎衰竭的預(yù)防與治療中，抑制自由基的產(chǎn)生，清除已產(chǎn)生的自由基及加強(qiáng)抗自由基等方法可作為抗腎間質(zhì)纖維化有效的措施。

1 Strutz F，Muller GA.Renal fibrosis and the origin of the renal fibroblast〔J〕.Nephrol Dial Transplant，2006;21(12):3368-70.

2 Moriyama T，Kawada N，Nagatoya K，et al.Fluvastatin suppresses oxidative stress and fibrosis in the interstitium of mouse kidneys with unilateral ureteral obstruction〔J〕.Kidney Int，2001;59(6):2095-103.

3 Arago M，Cutrin JC，Mastrocola R，et al.Oxidant stress and kidney dysfunction due to ischemia/reperfusion in rat〔J〕.Kidney Int，2003;64(3):836-43.

4 Noiri E，Nakao A，Uchida K，et al.Oxidative and nitrosative stress in acute renal ischemia〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2001;281(5):F948-57.

5 Klahr S.Progression of chronic renal disease〔J〕.Heart Dis，2001;3(3):205-9.

6 Nishiyama A，Abe Y.Molecular mechanisms and therapeutic strategies of chronic renal injury:renoprotective effects of aldosterone blockade〔J〕.J Pharmacol Sci，2006;100(1):9-16.

7 Sunami R，Sugiyama H，Wang DH，et al.A catalasemia sensitizes renal tubular epithelial cells to apoptosis and exacerbates renal fibrosis after unilateral ureteral obstruction〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2004;286:1030-8.

8 Liu Y.Renal fibrosis:new insights into the pathogenesis and therapeutics〔J〕.Kidney Int，2006;69(2):213-7.

9 Hirschberg R，Wang S.Proteinuria and growth factors in the development of tubulointerstitial injury and scarring in kidney disease〔J〕.Curr Opin Nephrol Hypertens，2005;14(1):43-52.

10 Sugiyama H，Kobayashi M，Wang DH，et al.Telmisartan inhibits both oxidative stress and renal fibrosis after unilateral ureteral obstruction in acatalasemic mice〔J〕.Nephrol Dial Transplant，2005;20(12):2670-80.