路鑫鑫 (西北民族大學(xué)化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730124)

天然植物藥物具有多種生物學(xué)效力，人參為中國等東方國家的傳統(tǒng)中藥，人參皂甙是近年來從人參中分離出的主要有效單體成分之一，用于一些慢性病的治療取得了很好的療效〔1〕。本研究以2型糖尿病胰島素抵抗大鼠為模型，探討人參皂甙對模型鼠胰島素抵抗的逆轉(zhuǎn)活性及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑 人參皂甙購自云南植物藥業(yè)有限公司，使用時溶于蒸餾水中。Trizol(分子探針公司)，RT-PCR和熒光定量檢測Real Time試劑盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕。

1.2 方法

1.2.1 動物分組以及2型糖尿病模型的建立 雄性Wistar大鼠50只，體重(230±15)g，購自本校實(shí)驗(yàn)動物中心，按清潔級動物分籠喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)、安靜。隨機(jī)分成兩組，正常對照組(n=10)及實(shí)驗(yàn)組(40只)。按文獻(xiàn)〔2〕的方法對實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行造模，檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液(0.1 mol/L;pH4.5)新鮮配制鏈脲佐菌素(STZ)溶液(30 mg/kg)腹腔注射，并喂飼高脂高熱量飼料6 w，對照組注射等量的無菌枸櫞酸緩沖液。6 w后測空腹血糖(FPG)，取FPG≥11.1 mmol/L或糖耐量實(shí)驗(yàn)異常者視為造模成功。造模成功的大鼠按體重隨機(jī)分成模型對照組、人參皂甙治療組?？瞻捉M飼以普通飼料，模型組和人參皂甙組繼續(xù)飼以高熱飼料(2%膽固醇、0.5%牛膽酸鈉、10%豬油、5%蔗糖、5%蛋黃粉，77.5%基礎(chǔ)飼料)。

1.2.2 給藥方法 第7周開始給藥，每日1次，人參皂甙治療組每日給藥50 mg/kg，模型對照組每日灌服等量生理鹽水，連續(xù)給藥30 d。

1.2.3 標(biāo)本采集與檢測 末次給藥后禁食12 h，各組動物用拜安易血糖儀測FPG后，按體重分別灌服25%葡萄糖液(葡萄糖0.25 g/100 g體重)2 h后，測餐后2 h血糖(2 h BG)。用放射免疫法測定空腹胰島素(FINS)，用胰島素敏感指數(shù)〔ISI，ISI=Ln(FPG·FINS)－1〕衡量胰島素的抵抗程度〔3〕。

1.2.4 目的基因的熒光定量檢測 取肝臟組織50 mg，加入1 ml Trizol液，充分勻漿，按照Trizol說明書操作，提取細(xì)胞總RNA。步驟如下:加入0.2 ml氯仿，混勻，靜置3 min，4℃離心，12 000 r/min，10 min，取上清液加入 0.5 ml異丙醇，靜置10 min，12 000 r/min，4℃離心 10 min，棄上液，加入 4℃ 1 ml 75%乙醇，12 000 r/min 4℃離心 5 min，棄上液，真空干燥5 min，50 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解，－70℃保存。

熒光定量檢測按照Real Time試劑盒說明書操作，使用ABI7900熒光定量PCR儀檢測磷脂肽肌醇3激酶(PI3K)P85亞基的表達(dá)。PI3K基因:上游引物5'-ATGGTGAAGGTGGATTGG-3'，下游引物5'-TAGCGTTGGGTTTGAGAT-3'，擴(kuò)增片段長度為313 bp;內(nèi)參照 GAPDH基因:上游引物5'-GGATTTGGTCGTATTGGG-3'，下游引物 5'-GGAAGATGGTGATGGGATT-3'，擴(kuò)增片段長度為 205 bp。反應(yīng)條件為:95℃ 15 s，55℃1 min，30 個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)資料以±s表示，顯著性差異采用Student's-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 人參皂甙對2型糖尿病胰島素抵抗大鼠ISI的影響 選用的40只 Wistar造模大鼠有33只造模成功，成功率為82.5%，造模成功的大鼠其中16只納入模型對照組，17只納入人參皂甙治療組。給藥前糖尿病模型組ISI都明顯低于正常對照組(P＜0.01);而給藥后與模型組相比，人參皂甙治療組使ISI得到顯著性提高(P＜0.05)。見表1。

2.2 人參皂甙對2型糖尿病胰島素抵抗大鼠PI3K信號通路的影響 正常對照組、模型對照組、人參皂甙治療組PI3K P85基 因擴(kuò)增的ΔΔCT值分別為:13.21±1.04、9.57±0.82、16.78±1.65，PI3K在模型對照組中表達(dá)減少，而在人參皂甙治療組中表達(dá)增加，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠ISI的比較(±s)

表1 各組大鼠ISI的比較(±s)

與正常對照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 n 給藥前 給藥后正常對照組10 －3.46±0.12 －3.31±0.14模型對照組 16 －6.77±0.291) －6.44±0.30人參皂甙治療組 17 －6.59±0.411) －5.03±0.272)

3 討論

2型糖尿病主要病理生理機(jī)制為胰島素抵抗和/或胰島素分泌不足，最近的研究顯示胰島素抵抗不僅是2型糖尿病的主要病理生理機(jī)制，同時還是高血壓、高血脂等老年常見疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因。因此，針對胰島素抵抗的治療和研究將會具有廣闊的應(yīng)用前景。中醫(yī)中藥治療糖尿病具有悠久歷史，近期大量研究表明中醫(yī)藥對胰島素抵抗的治療具有一定優(yōu)勢，使得中醫(yī)藥改善胰島素抵抗已成為糖尿病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)〔4〕。人參味甘、微苦，補(bǔ)氣生血，具有抗氧化的功效，在我國已有數(shù)千年的使用歷史。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明其主要的活性成分人參皂甙對人體免疫、心血管、神經(jīng)和內(nèi)分泌等多個系統(tǒng)均有作用。本文結(jié)果也顯示人參皂甙可以顯著提高模型鼠的ISI，具有好的逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗的活性。

PI3K-Akt通路為胰島素受體通路的主要下游信號通路，胰島素與其細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后，激活PI3K-Akt通路，導(dǎo)致下游一系列生化反應(yīng)的發(fā)生，所以在胰島素抵抗時PI3K通路活性往往會降低。結(jié)果顯示與正常對照組相比，人參皂甙治療組增加了PI3K的表達(dá)，模型對照組降低了PI3K的表達(dá)，說明人參皂甙可以通過上調(diào)PI3K信號通路逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗。

綜上所述，人參皂甙可以有效地干預(yù)糖尿病模型鼠的胰島素抵抗，在肝臟組織中有顯著的促進(jìn)PI3K通路的活性。

1 Li L，Sheng YX，Zhang JL，et al.High-performance liquid chromatographic assay for the active saponins from Panax notoginseng in rat tissues〔J〕.Biomed Chromatogr，2006;20(4):327-35.

2 鄭海生，金智生，劉 凱，等.紅芪多糖對2型糖尿病胰島素抵抗大鼠胰島素敏感性影響的研究〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010;28(7):1516-8.

3 李光偉，潘素仁，Lilliija S，等.檢測人群胰島素敏感性的一項(xiàng)新指數(shù)〔J〕.中華內(nèi)科雜志，1993;32(10):656-8.

4 武文慧.中醫(yī)藥治療Ⅱ型糖尿病胰島素抵抗的研究現(xiàn)狀綜述〔J〕.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2004;23(6):40-2.