謝瑞萍

(云南省文山州食品藥品檢驗所,云南 文山 663000)

復方龍膽片是文山州中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)療機構制劑,處方由龍膽草、牡丹皮、車前子、蒼術等 17味藥組成,具有疏肝利膽、清熱涼血等功效。主要用于肝膽濕熱、肝炎、膽囊炎等。龍膽草為該處方中的主藥,具有清熱燥濕、利肝膽、健胃、消炎等功效,其主要有效成分是龍膽苦苷[1]。為了更好地控制該藥品的質(zhì)量,保證該藥的用藥安全,本實驗以龍膽苦苷為考察指標,參考了相關資料[2～4],建立了高效液相色譜法測定其含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Ultimate 3000高效液相色譜儀(P680ALPG-4泵、ASI-100進樣器、VWD-3100檢測器);HS6150D超聲波清洗器(功率250W,頻率50KHz);AEG-120G電子分析天平,BP211D電子分析天平。

1.2 試藥 復方龍膽片:文山州中醫(yī)醫(yī)院提供,批號20080416、20080605、20080529、20090331;陰性對 照樣品 自制;龍膽苦苷對照品(批號110770-200611,供含量測定用)由中國藥品生物制品檢定所提供;甲醇為色譜純;水為純化水;其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性條件 色譜柱:Waters Symmetry C18柱(250 mm×Φ 4.6 mm,5μm);流動相:甲醇-水(23:77)[5];檢測波長:270 nm;柱溫:40 ℃;流速:0.8 mL/min;進樣量:10 μ L;理論塔板數(shù)按龍膽苦苷峰計算不低于3000[6]。在此色譜條件下,龍膽苦苷與其他組分的分離效果較好。

2.2 提取時間的考察 超聲處理不同時間,即 15、25、35、45 min,結果見表1,從表中可得到,35 min和45 min提取的龍膽苦苷含量相差甚微,因此選用省時、經(jīng)濟的超聲35 min作為前處理方法。結果見表1。

表1 提取時間考察

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取以五氧化二磷為干燥劑減壓干燥24 h的龍膽苦苷對照品10.76 mg置100 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,作為對照品儲備液(0.1076 mg/mL)。

2.4 供試品溶液的制備 取本品20片,精密稱定,研細,取細粉約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50 mL,密塞,稱定重量,超聲處理 35 min,放冷,再稱定重量,用甲醇補足損失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液用微孔濾膜(0.45μm)濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.5 陰性對照溶液的制備 取處方中除龍膽草以外的所有藥材,按處方劑量及制法和工藝要求制備缺龍膽草的陰性對照樣品,按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2.6 專屬性試驗 精密吸取供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液 10 μ L,分別注入色譜儀,結果見圖1。從圖中可看出,在與龍膽苦苷對照品相同的保留時間處,供試品溶液出現(xiàn)了相同的色譜峰,陰性對照溶液在此位置處未出現(xiàn)色譜峰,結果表明在此色譜條件下,其它組分對龍膽苦苷峰無干擾。

2.7 線性關系考察 分別精密量取對照品溶液 1、3、5、7、9 mL置10 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,分別精密吸取10 μ L,注入色譜儀,記錄峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標,以峰面積為縱坐標,制備標準曲線,可得回歸方程為Y=-0.2015X+21.7231,r=0.9998,結果表明,龍膽苦苷在 0.01076～0.1076μg/μ L之間,質(zhì)量濃度與峰面積值呈良好的線性關系。

2.8 精密度試驗 精密吸取對照品溶液,重復進樣5次,計算得龍膽苦苷峰面積的RSD值為0.899%。

2.9 穩(wěn)定性試驗 精密吸取對照品溶液,分別于0、1、2、4、8、12 h各進樣1次,測定樣品中龍膽苦苷峰面積,并計算其RSD值為1.315%,表明對照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 重現(xiàn)性試驗 取同一批號樣品6份,分別制備供試品溶液,進樣測定,龍膽苦苷平均含量為9.13 mg/g,RSD值為1.21%,結果見表2。

圖1 復方龍膽片中龍膽苦苷的高效液相色譜圖

2.11 加樣回收率試驗 稱取已知含量的同一批號樣品6份,每份 0.25 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入濃度為0.0430 mg/mL的龍膽苦苷對照品溶液(另配)50 mL,按“2.4”供試品溶液的制備方法制備,進樣測定,計算回收率,結果見表3。

表3 加樣回收試驗結果

2.12 樣品測定 按“2.4”項供試品溶液的制備方法制備5個不同批號的樣品,按“2.1”項的色譜條件測定,并計算含量,結果見表4。

表4 含量測定結果

3 討論

3.1 供試品提取時間考察 本試驗考察了不同提取時間(15、25、35、45 min),結果發(fā)現(xiàn) 35 min、 45 min 所提取的量略高于 15 min和25 min的,而35 min與45 min相比差異較小,綜合考慮,最后選擇35 min作為供試品的提取時間。

3.2 檢測波長的選擇 本實驗考察了不同的波長,其中主要對238 nm和270 nm進行了比較,結果發(fā)現(xiàn)在238 nm處,某組分的色譜峰干擾龍膽苦苷峰,為了排除雜質(zhì)峰的干擾,因此,選擇270 nm作為檢測波長。

3.3 色譜柱的選擇 本實驗選用了Waters Symmetry C18柱(250 mm×Φ 4.6 mm,5μm)和 Hanbon Sci&Teeh Lichrospher C18柱(150 mm×Φ4.6 mm,5μm)不同的色譜柱,結果發(fā)現(xiàn) Hanbon Sci&Teeh Lichrospher C18柱(150 mm×Φ4.6 mm,5μm)也能達到基線分離,但柱效較低,因而選用Waters Symmetry C18柱(250 mm×Φ4.6 mm,5μm)柱。

在上述色譜條件下,龍膽苦苷峰均在19min左右出現(xiàn),色譜峰形理想,分離度好,理論塔板數(shù)高于3000。此方法簡單、快捷、穩(wěn)定性好,可用于復方龍膽片中龍膽苦苷的含量測定。

[1]陳文華,張淑杰,管春梅,等.HPLC測定龍膽草中龍膽苦苷的含量[J].中國醫(yī)學檢驗雜志,2004,5(3):246～247.

[2]張良.金膽片中龍膽苦苷的含量測定[J].中國醫(yī)藥指南,2008,6(24):250～251.

[3]王發(fā)義,陳天祥.高效液相色譜法測定苦膽草片中龍膽苦苷的含量[J].中國民間醫(yī)藥,2008,(5):32～35.

[4]莊緒會,孫嬌,張慶芝.昆明龍膽與滇龍膽中龍膽苦苷含量的比較[J].云南中醫(yī)學院報,2010,33(1),12～14.

[5]劉瑞新.HPLC同時測定龍膽瀉肝丸中龍膽苦苷和梔子苷的含量[J].中成藥,2007,29(8):1170～1172.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].I部.北京:化學工業(yè)出版社,2010:89.